二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段，设计了2套LAMP引物，并各添加1条FD荧光探针，2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光，MS阳性对照发出绿色荧光，双重模板经过图像融合后为黄色荧光；特异性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原，对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应；敏感性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10² copies和1.9×10² copies;使用该方法检测40份临床样品，检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上，该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果，为不同条件的实验室提供了新的检测手段。     

一例禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染的实验室诊断

2013年3月,江苏省宝应县某蛋鸡场饲养的一批5 000羽海蓝褐商品代蛋鸡从170日龄开始部分鸡陆续发生关节炎,部分病鸡肝脏还可见白色坏死点,累计发病率超过30％.无菌采集发病鸡肝脏和关节腔积液,分别用麦康凯琼脂平板和血平板进行细菌分离,结果均为阴性.根据禽呼肠孤病毒（ARV） σB基因和滑液囊支原体（MS） vlhA基因分别设计引物用于两种病原体的PCR检测,结果显示,以病鸡肝脏组织和关节腔积液提取的RNA样品为模板,通过RT-PCR均可扩增出约900 bp大小的ARV特异性条带,以关节腔积液提取的DNA样品为模板,通过PCR亦可扩增出200 bp大小的MS特异性条带,结合流行病学特征,可以将该鸡场暴发的疾病确诊为禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染.     

基于便携式荧光定量PCR仪的鸡传染性贫血病毒检测方法的建立及应用

本研究参照Gen Bank中鸡传染性贫血病毒基因组序列,设计特异引物和TaqM an探针,通过优化反应条件,建立了能检测鸡传染性贫血病毒的荧光PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法检测鸡传染性贫血病毒灵敏度可达2.69TCID50/100μL,该法对禽呼肠孤病毒(AR V)、马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqM an荧光定量PCR检测方法可对鸡传染性贫血病毒进行快速鉴别诊断,为鸡传染性贫血的诊断及防控净化工作奠定了基础。     

微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。     

鸡细小病毒与禽呼肠病毒二重PCR检测方法的建立

建立可同时检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)与禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)的二重PCR方法,为防控ChPV与ARV提供技术支撑。根据鸡细小病毒NS1基因和禽呼肠病毒σC基因的保守序列,设计合成两对引物用于检测ChPV和ARV,通过优化二重PCR的反应体系,特异性、敏感性试验评价建立的ChPV与ARV二重PCR。优化后的二重PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中ChPV与ARV的上、下游引物各1.0μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足25μL;最佳的反应程序为:95℃5min;95℃1min,56.1℃1min,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。结果显示,建立的二重PCR能够同时扩增出204bp ChPV和405bp ARV片段;该方法对ChPV与ARV的检测敏感性分别达到58fg和53fg,但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增,对ChPV与ARV混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果符合率为94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV与ARV感染的快速鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡，引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求，建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法，使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物，使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系，优化探针浓度和反应温度，使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验，最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示，建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min，可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA，并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料，发现有3份ARV阳性，与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明，本研究建立的ARV RT-R...     

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485 bp、ALV 673 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立禽呼肠孤病毒(ARV)快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出ARV S1基因中298bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了ARV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝,与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床ARV的检测。     

鸡病毒性关节炎实时荧光RT-PCR检测方法的建立

本文旨在建立实时荧光RT-PCR方法检测鸡病毒性关节炎病原,针对特异性的禽呼肠孤病毒S1基因设计了1对引物及探针,经优化反应体系,确定引物和探针的最优浓度配比,建立了鸡病毒性关节炎实时荧光RT-PCR检测方法。结果显示:该方法灵敏度高、特异性强、检测时间短,可应用于鸡病毒性关节炎的普查监测和检验检疫。     

鸡毒支原体与滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡毒支原体(MG)与滑液囊支原体(MS)双重PCR检测方法,一次反应即可诊断鸡毒支原体与滑液囊支原体感染情况。根据GenBank公开的MG和MS基因序列,设计了2对质粒构建引物和2对检测引物,优化检测反应体系与条件,进行灵敏性试验、特异性试验和临床检测应用。结果显示,该方法对MG和MS阳性质粒的最低检测限为10拷贝/μL;与常见的H9禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、Ⅰ群禽腺病毒4型、副鸡嗜血杆菌和鸡大肠埃希氏菌6种病原无交叉反应;应用该方法检测335份样品,MG单阳性率为7.8%,MS单阳性率为31.3%,MG和MS双阳性率为17.0%,两种支原体总的感染率为56.1%。成功建立了检测MG和MS的双重PCR检测方法,为流行病学调查和诊断提供了可靠的技术手段。     

禽呼肠孤病毒RT—LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠孤病毒（Aviem reovirus,ARV）S1基因序列设计了特异对应靶序列中的6个基因区段的4条引物,以此建立了一种快速、准确的ARV逆转录环介导等温扩增（RT—LAMP）检测方法,并对此方法的反应条件进行了优化。结果表明,该方法能够特异地扩增ARV,而对其他常见的禽类病毒均无扩增作用,特异性强、重复性好;检测ARV的灵敏度为4ELD50,是RT-PCR方法的10倍;在反应产物中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。     

Taqman探针荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒方法的建立

本试验旨在研究建立Taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒的方法.根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了1对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物和1条用荧光基团标记的Taqman探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验.结果显示该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料,与常规RT-PCR检测和病毒分离结果吻合.本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,该方法适合用于检测鸡中C亚型禽肺炎病毒的存在.     

禽呼肠孤病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立及病毒组织分布比较研究

根据本实验室分离禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)毒株和GenBank中已发布ARV标准毒株σC基因序列比对结果,在保守区域设计1对引物和1条特异性TaqMan探针。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的Real-time RT-PCR在1×10~1~1×10~(10) copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到10 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。本研究建立的RTPCR与其他禽病病原无交叉反应,且批间与批内重复性试验变异系数分别小于1%和2%,表明该方法具有良好的特异性和重复性。将本实验室分离流行毒株MS01和标准毒株S1133感染SPF鸡后,利用建立的Real-time RT-PCR对ARV在鸡体内组织脏器的分布及病毒载量进行比较研究,结果表明,毒株MS01及S1133对SPF鸡的致死率分别为80%和46.7%,两株病毒均能在肝脏、脾脏、肺脏中有效复制,毒株MS01病毒载量明显高于毒株S1133,但与毒株S1133不同,毒株MS01在肾脏组织中也能有效复制。本研究不仅为禽呼肠孤病毒的诊断提供了技术手段,也有利于进一步探索流行毒株MS01高致病性的分子机制。     

黄羽肉鸡滑液支原体和鸡病毒性关节炎的鉴别诊断和防治

鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）病鸡冠髯苍白、跛行和发育迟缓，跗关节或爪垫肿胀，病鸡因疼痛不愿站立。禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）引发的鸡病毒性关节炎，主要危害肉鸡，引起鸡的关节炎、腱鞘炎。2种疾病均引起黄羽肉鸡瘫痪临床不易区分，本文拟通过临床症状、剖检变化对2种疾病进行鉴别诊断，并提出相应的防治措施。     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较.试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenI两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较.结果 显示,两种...     

禽(鸡)呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是呼肠孤病毒科呼肠孤病毒属的成员,为无囊膜、双股RNA病毒。ARV呈世界性分布,可感染鸡、火鸡及其他禽类。ARV的基因组可分为L(L1、L2、L3)、M(M1、     

麻鸡病毒性关节炎的诊治

<正>鸡病毒性关节炎是由禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)引起的一种传染病,ARV属于呼肠病毒科、呼肠病毒属的成员,为无囊膜、双股RNA病毒。该病由Olso等于1957年首次发现于美国     

1例土鸡多种病原混合感染引起关节炎的诊断

<正>鸡关节炎是养禽业中较常见的一种疾病,可由细菌、病毒和支原体引起。其中细菌性关节炎主要是由大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌等引起;病毒性关节炎主要由禽呼肠孤病毒(ARV)引起;支原体病是由鸡滑液囊支原体(MS)引起。此外,某些营养性疾病如日粮中缺乏维生素D、日粮蛋白水平过高引起痛风和缺乏某些必需无机元素时也可引起鸡关节炎的发生[1]。鸡关节炎的主要症状为关节肿胀、发炎、单侧或双侧跛行,严重时病鸡卧地不起,造成行动不便、采食困难等     

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立

本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测.     

鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。