抗Iss抗血清抑制鸡大肠杆菌血清抗性的分析

iss基因是鸡大肠杆菌的毒力基因,与菌株的血清抗性有关。本研究采用GST-Iss融合蛋白免疫4~6周龄小鼠,间接ELISA检测抗血清效价,并检测鸡致病性大肠杆菌O2(O2血清型)、CVCC1553(O78血清型)菌株Iss蛋白的表达。通过体外血清抗性抑制试验及iss、ybtA、chuA基因实时荧光定量PCR,检测2株菌株的血清抗性变化及mRNA转录水平的改变。结果表明,鼠源抗Iss抗血清能够在体外试验中抑制O2、CVCC1553菌株的血清抗性,并降低iss、ybtA及chuA基因的转录,并且对不同血清型菌株均有效。由此推测,抗Iss抗血清可能通过降低血清抗性相关基因的转录,使致病性菌株的血清抗性下降。Iss蛋白可能具有制备亚单位疫苗的潜力。     

Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测

本试验以鸡源大肠杆菌O2血清型iss基因原核表达产物GST-Iss融合蛋白免疫SPF鸡,获得抗血清。采用间接ELISA法检测Iss蛋白在几种毒力强弱程度不同的鸡源大肠杆菌菌株中的表达情况,并通过检测菌株在血清中的存活状况,研究Iss蛋白与抗补体功能(血清抗性)及致病力的关系。结果表明,鸡源大肠杆菌Iss蛋白与菌株的血清抗性及菌株的致病力有相关性。     

鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用

本试验以鸡E.coli强致病力菌株HO2的iss基因原核表达产物GST-Iss融合蛋白,免疫SPF鸡获得抗血清。分别检测菌株HO2在抗血清及正常血清中的存活状况,通过比较两者差别,探讨iss基因原核表达产物的免疫保护作用。结果显示,所获鸡大肠杆菌iss基因原核表达产物的抗血清能够减弱菌株的血清抗性,对鸡E.coli强致病力菌株HO2有抑制增殖或杀灭的作用。     

缺失rfaH基因的鸡白痢沙门氏菌株的构建及鉴定

为研制可以鉴别检测基因缺失型鸡白痢疫苗与自然感染菌,本研究通过基因同源重组技术,利用高效自杀性载体系统,敲除鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)CVCC 79201株的rfaH基因,同时未引入任何抗生素抗性基因等外源DNA序列,经筛选获得重组S.pullorum(rSp)株。检测结果显示缺失菌由光滑型转变为粗糙型。rSp在普通琼脂培养基上传15代后,仍然保持粗糙型表型。动物试验结果表明,rSp免疫伊莎褐蛋鸡后,其抗血清可通过平板凝集试验与CVCC 79201免疫的血清相区分。本研究为S.pullorum缺失疫苗的研制提供了技术平台。     

猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白亚单位疫苗免疫效果观察

用超声波破碎并采用N-十二烷基肌氨酸钠进行猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白提取,提取物经SDS-PAGE电泳检测后制备成疫苗,以肌肉注射方式免疫SPF小鼠,于免疫前及免疫后每隔1周分别收集血清.以间接ELISA的方法检测血清中IgG抗体水平,同时用不同血清型大肠埃希菌菌株与免疫血清做玻板凝集试验和攻毒保护试验.结果表明,在免疫小鼠后的第28天左右机体内的抗体水平达到最高值,免疫血清能够与不同菌株发生凝集反应且不同菌株对小鼠的攻毒都具有免疫保护力,说明外膜蛋白不仅具有一定的免疫原性而且对不同菌株具有交叉免疫保护力,因此外膜蛋白亚单位疫苗作为一种新型疫苗可望适用于防控猪大肠杆菌病.     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与ChIL-2重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验

将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。     

猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从Mhp J株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和western blot检测重组蛋白表达及其免疫学活性.以该重组蛋白为抗原免疫兔制备抗血清,采用间接ELISA检测抗血清效价,并利用抗血清通过间接免疫荧光检测P52基因在AD-293细胞中的表达情况.结果表明,PCR扩增目的基因为1 202 bp,SDS-PAGE检测重组蛋白大小约52 ku,其表达量占菌体总蛋白的28%.Western blot检测表明,目的蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫活性.间接免疫荧光检测到P52基因在AD-293细胞中表达.本研究为构建P52蛋白腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

鸡STARD3胞外域的原核表达及其抗血清制备

为获得鸡类固醇激素合成急性调节蛋白结构域3(STARD3)胞外域融合蛋白的特异性抗血清,采用人工合成方法获得鸡STARD3胞外域基因,利用pGEX6P-1质粒及BL21(DE3)进行原核表达,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot及间接ELISA方法测定抗体特异性和效价。结果显示:获得了STARD3胞外域融合蛋白的特异性抗血清,效价大于1∶6 400。本试验为研究鸡STARD3蛋白功能奠定了基础。     

GPMV NA-1株致弱F基因真核质粒的构建及免疫试验

将本实验室致弱的GPMV F基因克隆到真核表达载体pCI-neo中,构建pCI-rf质粒,经脂质体法转染BHK细胞后,Western blotting检测pCI-rf能正常表达。采用pCI-rf和本实验室构建的含有GPMV的F基因的真核表达质粒pCI-f分别肌注7~9日龄雏鸡,间接ELISA检测抗体,并采用淋巴细胞增殖试验和特异性CTL杀伤活性试验对试验鸡的细胞免疫进行检测,最后做攻毒保护试验。结果表明,pCI-f和pCI-rf能诱导试验鸡产生细胞免疫和体液免疫应答,与LaSota疫苗比较,免疫效果没有显著差异。PCR扩增检测结果显示,未能从免疫雏鸡各组织的基因组中扩增出F基因片段。     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

A型禽流感病毒不同拷贝数基质蛋白胞外区基因的原核表达及免疫保护力研究

为研究含禽流感病毒(AIV)不同拷贝数基质蛋白胞外功能区(M2e)亚单位疫苗在SPF鸡体中的免疫保护效力差异,根据已发表的高致病性AIV M2基因序列设计合成两对引物,利用PCR技术扩增单个M2e基因片段,以此为基础顺次串联得到不同拷贝数的M2e基因片段,并将其克隆到pMAL-C2x载体中,构建不同拷贝数的A型AIV M2e基因的重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定。表达产物经纯化后免疫家兔、SPF鸡,制备抗M2e融合蛋白的多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光试验检测纯化的融合蛋白免疫原性,间接ELISA测定鸡血清抗体水平,表明MBP-3M2e融合蛋白的抗体水平较高,且MBP-3M2e亚单位疫苗产生最好的免疫保护力。     

空肠弯曲菌FliD蛋白的原核表达与抗原性分析

为获得空肠弯曲菌FliD蛋白并分析其抗原性,研究扩增空肠弯曲菌标准菌株11168 fliD基因并构建原核表达质粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化FliD重组蛋白;纯化后的His-FliD蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后收集小鼠血清,间接ELISA结果显示小鼠多抗血清效价为25 600,Westernblot结果显示多抗血清能够与重组蛋白His-FliD特异性结合。研究成功表达空肠弯曲菌FliD蛋白并初步分析其抗原性,为进一步研究空肠弯曲菌与宿主间相互作用及FliD蛋白作为候选亚单位疫苗奠定理论基础。     

猪大肠杆菌融合菌株R2灭活苗的研制及免疫试验

为了研究猪大肠杆菌融合菌株R2蜂胶灭活苗的免疫效果,试验以猪大肠杆菌原生质体融合菌株R2为菌种制备蜂胶灭活苗,采用肌肉注射方式免疫SPF小白鼠,以间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平,同时用2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株与免疫血清做玻片凝集试验,并对小白鼠进行攻毒保护试验。结果表明:该疫苗免疫性能较好,在免疫小白鼠后的第28,35天左右机体内的抗体水平达到最高值,融合菌株R2蜂胶灭活苗可对2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株的攻毒试验产生保护,而且安全性能良好,是一种效果较好的菌苗。说明融合菌株R2蜂胶灭活苗作为一种新型疫苗防控猪大肠杆菌病将成为一种可能。     

ILTVgB基因重组BCG菌株的构建及其免疫原性

gB基因是传染性喉气管炎病毒(ILTV)的主要保护性抗原基因,本试验以ILTV基因组为模板,利用PCR特异扩增出gB基因,将其连接到含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的表达载体pRR3上,从而构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pR-α-gB,再电转化至BCG中,形成重组菌株rBCG-gB.热激后gB蛋白在耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc2 155中高效表达,并且通过ELISA和Western blotting检测能够被抗ILTV gB蛋白的单克隆抗体识别.将106CFU的重组菌株rBCG-gB皮下注射免疫3周龄的SPF鸡,分别测定了淋巴细胞指数(SI),吞噬细胞的吞噬能力以及血清中IL-2和IFN-γ的水平,结果表明重组菌株rBCG-gB作为 .载体疫苗具有较强的免疫反应.动物保护试验结果表明,重组菌株rBCG-gB对鸡具有一定的免疫保护效果,能够保护SPF鸡抵抗ILTV强毒株的攻击,血凝抑制试验表明血凝抑制抗体滴度能够显著增加.     

鸡堆型艾美耳球虫Hsp90克隆表达及其核酸疫苗的免疫保护作用

利用RT-PCR方法从鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)子孢子中成功克隆热休克蛋白90(Hsp90)基因,并构建其原核和真核表达质粒pET30a-Hsp90和pVAX-Hsp90。重组表达的89 kD可溶蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western-Blot表明,其反应性和特异性良好。真核表达质粒pVAX-Hsp90体外瞬时转染间接免疫荧光检测可见成功表达。雏鸡真核表达质粒免疫后进行攻虫保护试验,结果表明,pVAX-Hsp90组较空载体组及PBS组增重极明显(P0.01),且肠道病变减轻,OPG减少,抗球虫指数为166.17。综上初步评价了Hsp90核酸疫苗的免疫保护作用,表明Hsp90是一种潜在的鸡球虫保护性抗原。     

抗新城疫多肽的特异性抗体被动免疫的保护作用

本试验研究了抗新城疫(ND)多肽的特异性抗体在鸡的被动免疫中的作用.将6组3周龄的鸡,分别以血凝素神经氨酸酶/融合蛋白(NH/F),核蛋白/磷蛋白(NP/P),基质蛋白(M)和NDV所有蛋白(ALL)的复合物,及紫外线致弱的NDV(UVNDV)和阴性血清进行免疫,在免疫后的2天采集血样,并攻击Texas GB NDV,利用间接血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VN)检测出在HN/F、所有的蛋白和UVNDV免疫组存在着抗体.在NP/P和M蛋白免疫的鸡中的抗体只有用ELISA才能检测出来,在免疫血清注射后的2天抗体效价下降2个指数.用HN/F、所有蛋白、UVNDV抗血清免疫的鸡可以抵抗强毒的攻击,而那些用NP/P、M蛋白和阴性血清免疫的鸡有ND的临床症状.在所有免疫鸡气管中分离的病毒都可以复壮,机体中存在的特异性抗体可以保护鸡抵抗强毒的攻击,但不能阻止鸡排毒.     

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Yp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果.结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用.首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力.     

多肽疫苗对猪圆环病毒2型的免疫保护效果研究

为检验猪圆环病毒2型(PCV-2)多肽疫苗对猪免疫保护的效果,采用非蛋白多糖载体耦联多肽作为抗原,以断奶仔猪为试验动物,设多肽疫苗组、常规市售Cap蛋白亚单位疫苗组和不同对照组进行免疫。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测其血清特异抗体(Ig G),当抗体达到一定水平时进行攻毒试验,对试验各组的临床症状、特征变化及带毒血症进行观察和动态检测,对圆环病毒易感组织进行病毒检测及组织病理学检查,最终评估该多肽疫苗的免疫效果及保护率。结果显示:多肽疫苗能够快速产生体液免疫应答,具有显著的免疫效果;攻毒后采集的各试验数据也表明该多肽疫苗具有很好的免疫保护作用。     

新城疫病毒F基因的真核表达及其免疫原性检测

为了探讨F基因在DNA免疫防制新城疫(ND)中的免疫原性,将NDV Z株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-H is-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNA NDV ZF。在脂质体作用下将pcDNA NDV ZF转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量F蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果证明,pcDNA NDV ZF基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。     

基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。