断奶仔猪对毒力基因缺失大肠杆菌的免疫应答

为研究猪水肿病大肠杆菌SLT-Ⅱe编码基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用构建的突变菌株(O139/SLT-Ⅱ e/07)口服免疫断奶仔猪后,检测突变菌株在仔猪肠道的定植情况,仔猪血清及粪便中的特异性抗体和细胞因子水平,并进行了免疫保护效力评价.结果显示,免疫后21 d仍能在实验1组(微胶囊口服免疫)和2组(直接口服免疫)的仔猪粪便中检出突变菌株;从免疫后第7 d、14 d和21 d开始,在实验1组血清样品中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、F18ab菌毛蛋白和O139抗原的IgG抗体(P/N＞2);从免疫后第7 d、14 d开始,在粪便中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、SLT-Ⅱ eB蛋白、O139抗原、F18ab菌毛蛋白的slgA抗体(P/N＞2);免疫仔猪血清中的INF-γ的含量升高;实验2组的血清特异性IgG水平和粪便中sIgA抗体水平比实验1组低;该突变菌株对仔猪具有免疫保护作用.研究结果表明该大肠杆菌基因突变株可作为仔猪水肿病口服疫苗的候选菌株.     

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp~-/asd~-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。     

猪大肠杆菌融合菌株R2灭活苗的研制及免疫试验

为了研究猪大肠杆菌融合菌株R2蜂胶灭活苗的免疫效果,试验以猪大肠杆菌原生质体融合菌株R2为菌种制备蜂胶灭活苗,采用肌肉注射方式免疫SPF小白鼠,以间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平,同时用2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株与免疫血清做玻片凝集试验,并对小白鼠进行攻毒保护试验。结果表明:该疫苗免疫性能较好,在免疫小白鼠后的第28,35天左右机体内的抗体水平达到最高值,融合菌株R2蜂胶灭活苗可对2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株的攻毒试验产生保护,而且安全性能良好,是一种效果较好的菌苗。说明融合菌株R2蜂胶灭活苗作为一种新型疫苗防控猪大肠杆菌病将成为一种可能。     

猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白亚单位疫苗免疫效果观察

用超声波破碎并采用N-十二烷基肌氨酸钠进行猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白提取,提取物经SDS-PAGE电泳检测后制备成疫苗,以肌肉注射方式免疫SPF小鼠,于免疫前及免疫后每隔1周分别收集血清.以间接ELISA的方法检测血清中IgG抗体水平,同时用不同血清型大肠埃希菌菌株与免疫血清做玻板凝集试验和攻毒保护试验.结果表明,在免疫小鼠后的第28天左右机体内的抗体水平达到最高值,免疫血清能够与不同菌株发生凝集反应且不同菌株对小鼠的攻毒都具有免疫保护力,说明外膜蛋白不仅具有一定的免疫原性而且对不同菌株具有交叉免疫保护力,因此外膜蛋白亚单位疫苗作为一种新型疫苗可望适用于防控猪大肠杆菌病.     

表达致PWD和ED保护性抗原重组菌的免疫效力

重组菌BL21（pFsFaeG）是能够同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原（F4、F18、Stx 2e）基因的基因工程重组菌。由IPTG诱导的重组菌制成抗原，经甲醛灭活后腹腔免疫小鼠，用间接ELISA法定期检测小鼠血清中的抗体产生情况，结果显示重组菌能够诱导小鼠产生针对上述3种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫攻毒保护试验表明，用大肠杆菌标准强毒株C83907（F4）、108／86（F18）和Stx 2e毒素攻毒后，重组菌诱导产生的抗体能够对小鼠提供80％以上的保护。     

副猪格拉瑟菌6个候选抗原对小鼠的免疫特性分析

旨在获得具有良好免疫效果的候选抗原,本研究原核表达了副猪格拉瑟菌6个具有潜在保护力的蛋白,对小鼠免疫后进行攻毒,以期筛选获得具有免疫保护效果较好的候选抗原,从而为开发具有交叉保护作用的副猪格拉瑟菌亚单位疫苗奠定基础。63只BALB/c小鼠随机平均分为9组：HPSNAG-1330、CyaY、HPSNAG-0978、HPSNAG-0140、AfuA以及Fe³⁺ABC-tbp 6个亚单位疫苗组、G.parasuis-5灭活苗组、攻毒对照组和空白组;亚单位疫苗组每种对应蛋白各免疫50μg·只^-1,灭活苗组免疫4×10⁹CFU,一免与二免间隔14 d,二免14 d后攻毒,副猪格拉瑟菌Nakasaki菌株攻毒剂量为1.26×10⁹CFU。在二免14 d后检测特异性抗体水平、淋巴细胞增殖和IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达,攻毒后观察小鼠的临床症状并观察肺、脾的组织病理变化。免疫组小鼠均能产生体液免疫反应;淋巴细胞增殖试验显示：除rAfuA外,其它重组蛋白均能刺激灭活苗组中小鼠淋巴细胞显...     

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型（PCV2）cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri,L.reuteri）,并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组（P<0.01）;流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。     

表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究

为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价.结果表明,免疫后小鼠特异性IgG、SIgA及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70％.结果表明rAd.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护.本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础.     

Montanide~(TM) Gel 01 ST水性佐剂对猪乙型脑炎活疫苗免疫小鼠后的早期免疫保护效果的影响

为评估Gel 01 ST佐剂对猪乙型脑炎活疫苗早期免疫保护的影响,本研究以小鼠为动物模型,测定水性疫苗佐剂Montanide~(TM) Gel 01 ST(Gel 01 ST)稀释猪乙型脑炎活疫苗协同免疫小鼠后的攻毒保护情况。以固定病毒含量的不同浓度的Gel 01 ST佐剂与固定佐剂浓度下,不同病毒含量的猪乙型脑炎活疫苗以腹腔免疫小鼠后14 d进行攻毒保护试验,结果显示Gel 01 ST佐剂浓度为10%,病毒含量为10~(7.0)pfu/m L时分别可获得良好的保护效果;以10%Gel 01 ST佐剂稀释猪乙型脑炎活疫苗(病毒含量为10~(7.0)pfu/m L)免疫小鼠,于免疫后不同时间采集血清测定抗体,并于免疫后不同时间进行攻毒保护试验。结果显示Gel 01 ST佐剂稀释的活疫苗免疫小鼠后从第4 d开始其血清抗体水平明显高于无佐剂组(p0.01),且从第7 d开始可提供100%的攻毒保护效力。本研究结果表明,Gel 01 ST佐剂能很好的诱发免疫小鼠的体液免疫应答,增强猪乙型脑炎活疫苗的早期免疫保护。本研究为Gel 01 ST佐剂在动物活疫苗中的应用提供了参考。     

鱼精蛋白增强抗原诱导早期体液免疫反应的研究

为探究鱼精蛋白(PP)对抗原诱导早期体液免疫反应的增强作用,本研究采用PP与鸡卵清白蛋白(OVA)联合免疫小鼠,利用ELISA方法检测了免疫后10d内小鼠血清特异性抗体、细胞因子表达变化水平,采用流式细胞术检测了PP对外周血CD4~+和CD8~+T细胞亚群的影响,并进行了免疫小鼠的攻毒保护试验。结果显示,PP能快速激活OVA诱导的特异性抗体(IgM、IgG)应答,促进Th2偏向的免疫反应(IgG1、IL-5、IL-10),而对Th1型免疫应答(IgG2a、IFN-γ)无显著影响。免疫后10d的外周血淋巴细胞流式细胞术检测结果显示,PP显著提高外周血CD4~+/CD8~+值。此外,PP作为佐剂显著提高了大肠杆菌疫苗免疫小鼠3d后的攻毒存活率,增强了大肠杆菌疫苗的早期免疫保护。本研究为PP作为候选疫苗佐剂及其临床应用潜力提供了实验依据。     

MTT法评价猪口蹄疫合成肽疫苗的细胞免疫应答

为评价猪口蹄疫合成肽疫苗免疫猪后的细胞免疫应答,用含有E、F两种多肽抗原的猪口蹄疫合成肽疫苗免疫猪,二免后两周采血分离猪外周血淋巴细胞,再用E、F两种合成肽及二者混合物对淋巴细胞刺激培养48 h,用MTT法检测特异性T淋巴细胞增殖反应。结果显示,在抗原E、F混合物浓度为50μg/mL时,抗原对免疫组淋巴结细胞的刺激增殖作用显著高于未免疫对照组（P〈0.01）。表明,该猪口蹄疫合成肽疫苗免疫猪能有效引起特异性T淋巴细胞免疫应答。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86SLT-ⅡeA基因的克隆与表达

为了克隆与表达致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因,试验以F107/86为模板,PCR扩增去掉信号肽的935 bp的SLT-ⅡeA亚单位基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间并测序,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:对筛选出的阳性重组质粒pGEX-SLT-ⅡeA-4测序并与GenBank登录的M36727序列比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-SLT-ⅡeA经SDS-PAGE分析其大小为58.3 ku;Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫原性。说明试验所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白。     

Immunogenicity and protective efficacy of two recombinant pseudorabies viruses expressing Toxoplasma gondii SAG1 and MIC3 proteins

Toxoplasma gondii is one of the most common parasitic pathogens in humans and warm-blooded animals, causing toxoplasmosis. One of the efficient ways to control this disease is immunization. In this study, two recombinant pseudorabies virus (PRV) expressing TgSAG1 (rPRV-SAG1) and TgMIC3 (rPRV-MIC3) based on the PRV vaccine strain were developed by homologous recombination and used for immunizing BALB/c mice. Ninety BALB/c mice were randomly divided into five groups including four experimental groups (inoculated twice in 4 weeks interval with PRV TK-/gG-/EGFP+, rPRV-SAG1, rPRV-MIC3, rPRV-SAG1+rPRV-MIC3, respectively) and one control group (inoculated with medium). All mice vaccinated with rPRV developed a high level of specific antibody responses against T. gondii lysate antigen (TLA), a strong increase of the splenocyte proliferative response, and significant levels of IFN-γ and IL-2 production. These results demonstrated that rPRV could induce significant humoral and cellular Th1 immune responses. Moreover, rPRV immunization induced partial protection against a lethal challenge with T. gondii RH strain, and neutralizing antibodies against PRV in a BALB/c mouse model. The mice immunized with the rPRV-SAG1 and rPRV-MIC3 cocktail could develop higher T. gondii-specific IgG antibodies and lymphocyte proliferative responses and conferred more efficient protection against T. gondii challenge. These results suggested that expression of protective antigens of T. gondii in PRV is a novel approach towards the development of a vaccine against both animal pseudorabies and toxoplasmosis.     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月～2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查，发现猪水肿病在海安地区呈零星散发性发生，发病率为0.31％～1．84％，死亡率为0．07％—0．56％，病死率为16．0％～35．0％。水肿病主要侵害仔猪，育成猪也偶有发生，一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌，经O血清型鉴定，5株为0139，2株为O45，O55、O93，O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa，STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测茵毛，共6个分离株带有SLT-2e基因，其中O139分离株5株，055分离株1株，其余6株均带STb基因。12个分离株中，单独表达F18菌毛的4株(O1392株，O45、O119各1株)，F5 F411株(O93)，F41 F181株(O139)，F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验，多数分离株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

猪囊虫病基因工程疫苗的体液与细胞免疫反应

为了探讨以 Ｉ Ｓ Ｃ Ｏ Ｍ 作佐剂的猪囊虫病基因工程疫苗的免疫机理,对其诱导的体液免疫与细胞免疫反应进行了测定。用上述疫苗免疫 ９ 头试验猪,采用间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测体液免疫反应及通过淋巴细胞转化试验、 Ａ Ｎ Ａ Ｅ染色试验、 Ｅ玫瑰花环形成试验等检测细胞免疫反应;用该疫苗和铝胶苗分别免疫昆明小鼠各 ２０ 只,分别检测体液免疫反应和 Ｔ 淋巴细胞抑制／杀伤亚群的动态变化。体液免疫的检测结果显示,免疫后 ７ 天即出现抗体,２１ 天后抗体全部转阳,持续的时间不少于 １９３ 天,效价明显高于铝胶苗;细胞免疫检测结果显示,免疫猪外周血 Ｔ淋巴细胞转化率、 Ａ Ｎ Ａ Ｅ＋ 细胞和粗粒型 Ａ Ｎ Ａ Ｅ＋ 细胞、 Ｅ Ｒ Ｆ Ｃ和 Ｅａ Ｒ Ｆ Ｃ细胞显著升高,免疫小鼠 Ｔ淋巴细胞抑制／杀伤亚群显著升高;与铝胶苗及对照组比较,差异极显著。以上结果表明猪囊虫病基因工程疫苗可同时激发动物的体液免疫和细胞免疫反应,增强了机体的免疫调节功能及杀伤性 Ｔ 淋巴细胞功能。     

猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的制备及免疫保护力

通过PCR方法克隆噬菌体PhiXl74的融菌基因E,将其与温控表达载体pBV220连接,成功构建温控融菌表达盒,设计扩增温控表达盒的2对引物,使其5′端分别与lacZ基因敲除基因的首尾50bp基因同源,使用Red系统同源重组,使用麦康凯平板筛选、PCR鉴定白色菌落,温控诱导融菌蛋白的表达,制备大肠杆菌O9的菌影,并对其融菌效率及免疫保护力进行了初步研究。结果显示,成功构建了温控融菌表达盒,经同源重组成功获得猪致病性大肠杆菌O9温控融菌株,温控表达溶菌蛋白能够成功抑制细菌的增殖,并使活菌数下降3个指数,对小鼠安全性好,皮下免疫组攻毒保护率达到71.43%。     

Oral vaccination with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing Cap protein of PCV2 and its immunogenicity in mouse and swine models

Attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) was selected as a transgenic vehicle for the development of oral vaccines against Porcine circovirus type 2 (PCV2). The Cap-encoding gene of PCV2 was amplified by PCR and cloned into expression vector pYA3341. The recombinant plasmid pYA3341-Cap was transformed into attenuated S. typhimurium X4550. BALB/c mice were inoculated orally with various doses of attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap. The bacterium was safe to mice at dose of 2×10(9)cfu and eventually eliminated in the spleen and mesenteric lymph nodes at 4 weeks post-immunization. The flow cytometry analysis showed that the percentage of CD4(+) T cells and CD4(+)/CD8(+) ratio were increased significantly in mice immunized with attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap. Vaccine tests in swine showed that the oral immunization with attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap could elicit significantly higher Cap antibody titers in the treated swine than the control groups. Virus neutralization test showed that serum from the swine treated with attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap had significant levels of neutralization activities. The swine lymphocyte proliferative responses indicated that attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap could induce obvious cellular immune response. An in vivo challenge study showed the swine treated with attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap had significantly lower PCV2-associated lesions and PCV2 viremia than the control groups. The results indicated that attenuated S. typhimurium X4550/pYA3341-Cap can be a potential vaccine against PCV2 infections.     

猪囊虫病基因工程疫苗的研制及应用

从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达，重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定，筛选保护性抗原基因。将具有免疫保护作用的重组抗原纯化，并与免疫刺激复合物佐剂结合，制成猪囊虫病基因工程疫苗。对工程菌的培养发酵、重组抗原的下游纯化及疫苗的配制、疫苗的中间试制进行了研究，确定了一套比较完善的生产工艺。应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型，应用该模型进行上述疫苗的免疫预防试验，免疫1次和2次的免疫保护率分别为96．9％和98．4％。本动物的免疫预防试验显示，疫苗安全性好，免疫保护率达92．2％，且免疫组发现的囊虫多数已死亡。在流行区进行了田间和区域试验。免疫猪未有不良反应，囊虫感染率分别由20％降为1．1％和5．4％降为0．21％。用该疫苗对人工感染的囊虫病猪进行免疫治疗，发现在感染早期的治疗效果较好。免疫动物的体液免疫和细胞免疫的检测结果显示，该疫苗刺激机体产生抗体的时间早、持续时间长、效价高；可显著提高淋巴细胞转化率及E－RFC和Ea-RFC细胞、ANAE^ 细胞和粗粒型ANAE^ 细胞、抑制／杀伤性T细胞亚群的数量。以上结果表明，用大肠杆菌表达的重组抗原制备的猪囊虫病基因工程疫苗安全、高效，且成本低廉，可规模化生产，有成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。     

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.