猪、鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析

对上海地区1个规模化养猪场和1个规模化养鸡场分离鉴定的40株粪肠球菌,采用微量肉汤稀释法对12种抗菌药物进行药敏试验,采用Riboprinter^®微生物基因指纹鉴定系统检测分离菌株的基因指纹图谱,分别检测分离菌株中的核糖体型和耐药性。结果表明,在40株粪肠球菌中,80%以上为多重耐药菌株,有4株猪源粪肠球菌对万古霉素耐药,其中有2株表现为对万古霉素高度耐药（MIC>64 mg/L）,且对链霉素和庆大霉素同时表现为高度耐药（MIC>2 048 mg/L）。从耐药表型和核糖体分型共同分析粪肠球菌的耐药性,发现多重耐药性严重,同一核糖体型菌株的耐药表型并非完全一致。     

毛皮动物源粪肠球菌的分离鉴定

为获得毛皮动物源粪肠球菌,并评价其益生特性,本研究从健康成年毛皮动物（水貂、狐狸、貉）粪便中分离粪肠球菌,通过形态学观察、生化试验和16S rRNA序列分析等方法进行种属鉴定。测定分离菌株生长曲线、产酸能力、抗菌药敏感性,并挑取部分菌株测定其对于温度、人工胃液、人工胆盐的耐受能力。结果表明,分离菌株中共5株为革兰氏阳性菌,生化特性与粪肠球菌标准株基本相符,且经16S rRNA序列分析鉴定为粪肠球菌。5株菌均于培养后2 h进入对数期,8~10 h进入稳定期,且具有弱产酸能力。分离菌株对四环素、左氟沙星耐药性强,耐药率为100%,其次为青霉素（80%）、红霉素（80%）、庆大霉素（80%）、氯霉素（40%）,对氨苄西林和万古霉素敏感。水貂、狐狸和貉源的粪肠球菌对于60 ℃以下温度处理、pH>3.0的人工胃液、0.3%~0.5%浓度的胆盐耐受能力较强,对70 ℃以上高温和pH<3.0的人工胃液耐受性差。综上所述,本研究共获得5株毛皮动物源（水貂、狐狸、貉）粪肠球菌,分离菌株繁殖较快,适合在毛皮动物肠道中定植并发挥益生作用,且具有较好的益生特性和抗逆性,可作为动物用微生态制剂的候选菌种进一步研究。     

石河子地区奶牛乳房炎源肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解石河子地区奶牛乳房炎源肠球菌的分布情况及耐药性,采集石河子地区乳房炎奶牛奶样进行肠球菌的分离,通过生化特性鉴定和16S rRNA通用引物进行PCR扩增,选用19种抗菌药物对肠球菌进行了耐药性试验。结果表明:从患乳房炎奶牛的乳样中分离出10株肠球菌;通过生化特性鉴定和16S rRNA通用引物进行保守区PCR扩增后测序确定其中有4株是屎肠球菌,6株是粪肠球菌;分离菌株对杆菌肽、新霉素、青霉素、头孢氨苄和卡那霉素基本全部耐药,对氯霉素、氟苯尼考和恩诺沙星相对敏感,两种肠球菌中未发现万古霉素耐药株。     

乌鲁木齐市宠物源粪肠球菌和屎肠球菌耐药性及耐药基因检测

为了解乌鲁木齐市宠物源粪肠球菌和屎肠球菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其耐药基因携带情况,在乌鲁木齐市多家宠物医院、警犬基地、犬养殖基地采集宠物(犬和猫)直肠粪样449份进行粪肠球菌和屎肠球菌的分离鉴定,通过琼脂稀释法测定10种抗菌药物的最小抑菌浓度,利用PCR方法检测11种耐药基因。结果分离鉴定出宠物源粪肠球菌和屎肠球菌共计123株,其中粪肠球菌81株,屎肠球菌42株。宠物源粪肠球菌和屎肠球菌对四环素和庆大霉素的耐药率较高,对阿米卡星、恩诺沙星和环丙沙星呈不同程度耐药,对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、万古霉素以及利奈唑胺高度敏感,仅部分屎肠球菌对亚胺培南表现耐药。检出aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、tetM、tetA和optrA耐药基因;其余被检耐药基因未检出。耐药粪肠球菌以同时携带aac(6′)/aph(2″)+aph(3′)-Ⅲ+tetM耐药基因为主;耐药屎肠球菌以携带tetM耐药基因为主。宠物源粪肠球菌与屎肠球菌对被检抗菌药物存在不同程度耐药,均对四环素类药物耐药最严重、对应耐药基因检出率也最高。建议临床治疗应根据细菌耐药性结果进行合理用药,并持续加强对宠物源肠球菌耐药性监测。     

饲料微生态产品中粪肠球菌含量检测方法的建立

本试验旨在建立一种饲料微生态制剂产品中粪肠球菌含量检测方法。采用生化鉴定和聚合酶链式反应(PCR)手段,建立了适用于饲料微生态制剂产品中粪肠球菌的确证方法;针对企业标准中常用的粪肠球菌培养基、肠球菌显色培养基、MRS培养基、哥伦比亚血琼脂4种培养基开展了粪肠球菌分离计数对比试验,最终筛选出粪肠球菌培养基作为检测饲料微生态制剂产品中粪肠球菌含量的计数培养基。该方法准确性高、操作性强、适用性广,能够满足企业生产与市场监督的需求。     

MALDI-TOF MS对猪源肠球菌的快速检测

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)和MALDI-Biotype 3软件对河南分离株肠球菌进行快速鉴定及同源性分析。使用甲酸提取法按照MALDI-TOF-MS要求进行样品制备,点靶并获取样品质谱图;运用Biotyper分析软件对所获取的质谱图进行鉴定和同源性分析。同时用Vitek-2全自动微生物鉴定系统进行辅助分析鉴定。结果显示,应用MALDI-TOF-MS方法鉴定的33株肠球菌中粪肠球菌13株,屎肠球菌20株,且可信度分值大于2.300,能完全鉴定到种的水平。PCA聚类分析显示,与屎肠球菌相比,粪肠球菌的亲缘关系更近一些。而Vitek-2对屎肠球菌的鉴定结果差异较大。结果表明,MALDI-TOF MS对肠球菌的快速鉴定和同源性分析,操作快速简便,准确率高,有利于兽医临床快速诊断,将成为兽医微生物常用诊断工具。     

五种动物源肠球菌耐药性监测

为了解不同动物源肠球菌耐药性,试验选用10种常用抗生素,采用统一材料、方法(KB法)和判断标准[美国临床实验室标准化协会(CLSI)2007年版]对从5种不同动物源(人、狗、鸡、牛、猪)粪便中分离得到的肠球菌进行耐药性检测。结果表明:共分离得到肠球菌646株,包括人源肠球菌146株、狗源肠球菌138株、鸡源肠球菌128株、牛源肠球菌111株、猪源肠球菌123株;各动物源肠球菌对四环素和利福平耐受性偏高,对青霉素G、万古霉素和高浓度庆大霉素耐受性偏低,其中耐万古霉素肠球菌47株,平均耐药率为7%;各动物源肠球菌的耐药性表现为鸡源肠球菌最强,猪源肠球菌、狗源肠球菌、人源肠球菌次之,牛源肠球菌最低。说明滥用抗生素已造成人和畜禽动物肠球菌较为普遍的耐药,应引起临床及畜禽业高度重视。     

河南省猪源粪肠球菌的分离、鉴定与耐药性分析

旨在掌握河南省猪源粪肠球菌的耐药情况。从规模化猪场抽取样品300批,采用常规方法进行粪肠球菌分离、培养、纯化,应用全自动细菌鉴定/药敏系统和PCR技术对分离菌株进行种水平鉴定,利用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性分析。结果表明,有154株分离菌被鉴定为粪肠球菌,总体分离率为51.33%;分离菌株对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、头孢噻呋、磺胺异噁唑、红霉素、替米考星等抗菌药物耐药严重,耐药率均在90%以上,对强力霉素(多西环素)、氟苯尼考、青霉素、复方新诺明耐药性相对较强,耐药率在60%~90%。综上提示,河南省猪源粪肠球菌耐药情况严重。     

犬粪肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了鉴定从拉萨市病犬的粪便中分离出的一株细菌的种属及耐药性,试验采用了革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA PCR扩增和序列比对及药敏试验的方法对该菌株进行了研究。结果表明:该分离菌株为革兰氏阳性菌,经16S rRNA PCR鉴定为粪肠球菌,仅对多黏菌素B和利奈唑胺表现高度敏感,对其他28种抗生素均表现耐药。说明从犬中分离出的粪肠球菌对多种抗生素都具有极高的耐药性。     

武汉市马源肠球菌的耐药性分析

肠球菌(Enterococci)作为条件性致病菌广泛存在于人和动物中,其耐药性和致病性随地区和动物来源的不同而变化。据现有数据显示,关于武汉市马源肠球菌的耐药性研究相当匮乏。以武汉市2个马术俱乐部42匹温血马为主要研究对象,分别对马匹粪便进行样品搜集并进行耐药研究(氨苄西林,四环素,庆大霉素,头孢氨苄,恩诺沙星,氯霉素,诺氟沙星,红霉素,万古霉素、林可霉素等)。结果显示,从42份样本中分离出10株粪肠球菌,分离率为23.8%;药敏试验结果显示,分离株中有6株为庆大霉素耐药,6株为头孢类抗生素耐药,2株为庆大霉素和头孢类抗生素混合耐药,其他药物未产生耐药性。结果表明该俱乐部马源肠球菌已对庆大霉素和头孢类抗生素产生严重耐药性,试验为该马术俱乐部用药提供了理论依据。     

猪源粪肠球菌的分离、鉴定及应用

通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、16SrDNA序列分析和种特异性片段扩增等方法,从健康猪直肠内容物中分离到3株粪肠球菌,其中菌株NA14对常见病原微生物具有较强的拮抗能力;进一步研究表明该菌株具有较强的耐受人工胃液和耐胆汁的能力,能够耐受60℃、30min;动物试验表明饲料中添加该粪肠球菌能够降低仔猪腹泻,改善仔猪生产性能,增强猪瘟疫苗的免疫效果;因此该菌株作为动物益生菌具有好的应用前景。     

一例由粪肠球菌感染引起的鸭死亡病例诊断

本研究通过流行病学调查、临床剖检及实验室病原分离等方法,从一例鸭死亡病例中分离出1株细菌,经染色镜检、全自动微生物分析系统检测、质谱检测、16S rDNA测序以及动物致病性试验等方法鉴定,确定分离到的细菌为粪肠球菌,并最终确诊该起鸭死亡病例由粪肠球菌感染引起。通过实施新霉素等药物治疗,鸭群逐渐恢复健康。该病例提示,要提高对鸭粪肠球菌感染的重视程度,加强鸭群日常饲养管理,做好生物安全防控,科学合理用药,这样可有效防范鸭群粪肠球菌感染发生。     

湖南省猪源肠球菌的分离鉴定

为了从猪粪便中分离出肠球菌,采用6.5%NaCl pH 9.6 TSB和麦康凯血平板两种方法分别对80个健康猪源样品和53个流行性腹泻猪源样品进行检测。结果显示,共分离出115株肠球菌,其中健康猪源肠球菌72株,包括粪肠球菌2株,屎肠球菌30株,其他肠球菌40株,检测率为90%;从流行性腹泻中共分离到43株肠球菌,其中粪肠球菌9株,屎肠球菌29株,其他肠球菌5株,检出率为81.1%,前者方法中其他肠球菌的检出率比较高,后者方法屎肠球菌的检出率比较高。两种方法各有侧重,为分离不同菌种的肠球菌提供依据。     

广东省养禽场肠球菌耐药性及毒力因子流行分布特征

旨在调查和分析广东省养禽场肠球菌的亚型屎肠球菌和粪肠球菌耐药性及其毒力因子流行分布特征,为控制禽源肠球菌耐药性传播、保障公共卫生安全提供理论依据。作者于2018年从广东省4个养禽场采集肠道样品493份,进行屎肠球菌和粪肠球菌的分离鉴定;采用琼脂二倍稀释法测定肠球菌的最小抑菌浓度（MIC）;PCR方法检测肠球菌的耐药基因和毒力基因。结果显示：1）共分离到125株肠球菌,其中粪肠球菌84株（鸡源66株,鸭源18株）;屎肠球菌41株,均来自鸡肠道样本。2）菌株对四环素、多西环素、红霉素几乎全部耐药,对氟苯尼考和氯霉素的耐药率高达89.60%和74.40%。屎肠球菌耐药率普遍高于粪肠球菌,而粪肠球菌对环丙沙星和利奈唑胺的耐药率高于屎肠球菌;鸭源粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率（94%）显著高于鸡源粪肠球菌（39.4%）,屎肠球菌对利奈唑胺均敏感。从鸡分离的1株粪肠球菌对万古霉素耐药。3）耐药基因在屎肠球菌中的检出率高于粪肠球菌,鸭源分离株检出率高于鸡源。耐药基因tetL、fexA、ermB最为流行,检出率均高于90%。其次是optrA基因,检出率为73.60%,poxtA和fexB的检出率均低于20%。在3株鸭源粪肠球菌中检测出cfr基因。4）已检测的毒力基因中efaA的携带率最高,为63.04%（58/92）,其他依次为gelE（54.35%,50/92）、ace（47.83%,44/92）、asa1（44.57%,41/92）。对环丙沙星及高浓度氨基糖苷类耐药的菌株及携带cfr基因的菌株,大多携带agg、asal、gelE或ace。本研究显示养殖场禽源肠球菌耐药严重,鸭源肠球菌对利奈唑胺耐药率高,耐药基因和毒力基因流行且多样,且检测出人医临床重要抗生素耐药基因,应加强对养禽场肠球菌耐药性监测。     

北京市伴侣动物源肠球菌的抗菌药物耐受情况调查

为研究北京市伴侣动物源肠球菌对常见抗菌药物的耐受情况,于2015年5月至2016年1月以北京市某宠物医院门诊就诊犬、猫作为采样对象,采集犬、猫自然排出的粪便作为样品,共得到样本320份。采用选择性培养基进行菌株分离和VITEK-2型全自动微生物分析仪进行肠球菌的鉴定;对分离鉴定的菌株进行8类11种常见抗菌药物敏感性试验;同时进行高水平庆大霉素和高水平链霉素耐受的检测试验,对受试肠球菌的耐药性和多重耐药性进行分析。共得到菌落形态及生化特性不同的非重复的肠球菌318株,其中粪肠球菌（49.06%）和屎肠球菌（29.87%）分离率较高。受试肠球菌对高水平庆大霉素和高水平链霉素的耐药率分别为39.94%和43.40%,对四环素（78.62%）、红霉素（67.30%）和奎诺普丁-达福普汀耐药率（43.71%）较高,对替加环素全部敏感,对万古霉素和呋喃妥因非耐药率也很高（均为98.74%）。受试肠球菌对1类到7类抗菌药物有不同程度的耐药性,多重耐药现象普遍,多重耐药率高达57.23%。耐受4类抗菌药物的数量最多（n=65株）。经分析共得到44种不同的耐药谱,以耐受4类药物的红霉素-奎诺普丁-达福普汀-四环素-高水平氨基糖苷类耐药谱占比最高（45/318,14.15%）。本研究证实受试的北京市伴侣动物源肠球菌对常见抗菌药物的耐药程度较高,多重耐药情况普遍存在,应加强对其耐药性的监测工作。     

江西省猪源粪肠球菌毒力基因及耐药性分析

通过选择性培养基、PCR技术分离鉴定粪肠球菌,采用PCR技术检测agg、clyA、efaA、esp、ace和gelE基因,使用K-B法测定分离株对红霉素、多西环素、环丙沙星和氟苯尼考的敏感性。结果共分离并鉴定出226株粪肠球菌。98.23%的粪肠球菌至少携带1种毒力基因,各基因检出率由高到低依次为efaA、ace、gelE、agg、esp和clyA。有75.22%分离株携带3~5种毒力基因。分离株对红霉素和多西环素耐药率较高,分别为97.35%和92.48%,对环丙沙星和氟苯尼考耐药率相对较低,分别为65.04%和61.95%,但没有统计学上的区别。因此,携带毒力基因数的多少与抗菌药物的耐药性之间不存在统计学上的关联。     

四种牛源益生菌的分离鉴定

为了确定牛奶中的益生菌种类,给奶牛微生态制剂益生菌菌种的选择提供参考,试验选取体况良好、无乳房炎、产奶性能优良的荷斯坦奶牛和新生犊牛,采集其新鲜奶样和粪样,应用MRS溴甲酚紫选择性培养基和革兰氏染色对分离株进行初步鉴定,提取菌株DNA检测16S rRNA基因并测序,对分离株进行分子生物学鉴定。结果表明:所得菌株中有球菌和杆菌,革兰氏染色呈阳性,得到的12株菌株分别为约氏乳杆菌2株、布氏乳杆菌4株、粪肠球菌5株和屎肠球菌1株。这些牛源益生菌可用于研制益生菌微生态制剂。     

某养殖场鸡源粪肠球菌分离鉴定及耐药性研究

本文从辽宁某鸡场100份肉鸡盲肠拭子中分离获得粪肠球菌24株,通过ATB细菌鉴定仪进行鉴定确认为粪肠球菌,并对这24株粪肠球菌进行了14种抗生素的药敏试验。结果显示,粪肠球菌对青霉素、万古霉素、氨苄西林和替拉考宁敏感;对红霉素、氯霉素、环丙沙星、四环素、左氧氟沙星和奎奴普汀/达福普汀耐药,耐药率均达到100.0%,养殖场抗菌药物耐药严重。     

北京地区腹泻犬、健康犬粪便粪肠球菌耐药性、毒力基因及多位点序列分型研究

为分析分离自北京地区腹泻犬、健康犬粪便的粪肠球菌的耐药性,研究2种犬粪便来源优势分子型粪肠球菌重要毒力基因携带情况,在中国农业大学教学动物医院收集犬粪便,并分离得到腹泻犬粪便源粪肠球菌45株,健康犬粪便源粪肠球菌32株,采用琼脂稀释法测定分离菌株对12种抗生素的最小抑菌浓度,用多位点序列分型(MLST)技术进行分子分型,并利用PCR方法检测优势分子型粪肠球菌5种不同毒力基因携带情况。结果显示,腹泻犬源和健康犬源粪肠球菌对四环素、多西环素、米诺环素、红霉素、利福平耐药率较高。腹泻犬源分离株对氯霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、呋喃妥因耐药率较低,集中于8.9%～17.8%,对万古霉素不耐药;健康犬源分离株对青霉素、呋喃妥因耐药率较低,分别为4.8%和14.3%,对氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、万古霉素不耐药。45株腹泻犬源粪肠球菌共发现15种序列型(ST),优势ST为ST116、ST16、ST179,32株健康犬源粪肠球菌发现18种ST,优势ST为ST16和ST27,2种来源优势ST粪肠球菌agg、gelE、cylB、esp、efaAs毒力基因检出率差异不显著(P0.05)。表明北京地区腹泻犬、健康犬肠道粪肠球菌多重耐药现象严重,需加强抗生素使用的监控和管理;腹泻犬、健康犬肠道粪肠球菌毒力基因携带率差异不显著,都具有向人传播致病性粪肠球菌的风险,兽医临床医护人员和宠物犬饲养人应注意防护。     

鸡源粪肠球菌的分离鉴定

试验选择9日龄健康肉仔鸡的肠道内容物,利用肠球菌琼脂培养基分离获得12株疑似肠球菌的细菌。通过对12株菌的生态特征、培养和生理生化特征的测定,筛选3株疑似粪肠球菌的菌株进行16S rDNA分子鉴定,最终获得3株粪肠球菌,命名为HEW-S05、HEW-S09和HEW-S12。为禽用微生态制剂的研制提供菌种来源。