多重PCR检测产气荚膜梭菌方法的建立及其临床应用

产气荚膜梭菌是牛羊猝死和肠出血症的重要病原之一。本研究根据其常见的A、B、C、D四种菌型菌株编码α、β和ε毒素的保守序列,分别设计合成了针对这3种毒素的特异性引物,建立了多重PCR检测不同血清型产气荚膜梭菌的技术方法。通过对参考菌株的分型检测表明,该方法不仅快速、客观,而且具有良好的特异性和敏感性。对羔羊猝死症中分出的菌株进行检测,确定其为产气荚膜梭菌A型和D型混合感染;对产后母牛血痢病料中分离的菌株进行检测确定其为产气荚膜梭菌A型。     

西藏那曲牦牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性

利用细菌培养、生化鉴定、小鼠致病性试验、PCR技术等方法对西藏那曲市多起牦牛猝死病例进行诊断和分析。结果表明,从病死牦牛脏器中分离得到3株产气荚膜梭菌,命名为AD-01、AD-02和BG-01。其中AD-01和AD-02分离株属于A型,BG-01分离株属于C型。通过对分离株16S rRNA进行序列比对并制作进化树分析发现,AD-01和AD-02分离株为A型产气荚膜梭菌,与中国近年来报道的分离菌株遗传距离较远,属于完全独立的一个分支;同时药敏试验结果显示AD-01、AD-02分离株与BG-01分离株的药敏试验结果有一定差异,产生此现象的原因需进一步研究。本试验成功分离到3株牦牛源产气荚膜梭菌,为牦牛产气荚膜梭菌病的预防和控制提供了理论依据。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

青岛地区兔源产气荚膜梭菌的分离鉴定及遗传多样性分析

兔的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的严重危害养兔业的一种疾病,为了更好地控制此病,本研究调查了青岛地区规模化兔场爆发此病时产气荚膜梭菌的毒素型及遗传多样性。2010年11月-2012年5月期间,采集青岛地区规模化养兔场疑似产气荚膜梭菌感染兔的肝脏进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用Multiple—PCR方法对分离菌株进行毒素型分析,应用ERIC-PCR方法分析分离菌株的遗传多样性。共分离到25株产气荚膜梭菌,其中A型24株（96％）,C型1株（4％）。用ERIC—PCR方法将25株分离株分于9个聚类中,其中V型为主要流行型。结果表明：青岛地区规模化兔场中产气荚膜梭菌流行的毒素型主要为A型,且具有多种基因亚型,其中V型为主要流行型。此结果为该地区兔产气荚膜梭菌病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备及免疫学评价

产气荚膜梭菌是引起犬猝死症的主要病原菌,目前临床上还没有预防犬猝死症的疫苗。本试验以分离自犬的A型产气荚膜梭菌为制苗菌株,首先对利用甲醛进行产气荚膜梭菌培养液脱毒的浓度和时间进行了优化,然后利用脱毒后的产气荚膜梭菌培养液对小鼠和犬进行免疫,并对不同佐剂(铝佐剂和油佐剂)和不同免疫途径(皮下注射和腹腔注射)的免疫效果进行评价。结果显示,产气荚膜梭菌灭活疫苗具有良好的免疫保护效果,免疫后小鼠体内可产生高水平的血清抗体,抗体效价最高可达6.25×104。产气荚膜梭菌铝胶灭活疫苗对犬具有良好的安全性,单次免疫(4mL/只)或2次免疫(2mL/只)均可产生良好的免疫保护效果(5/5)。结果表明,本试验制备的犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗可用于预防犬产气荚膜梭菌感染。     

鹿出血性肠炎病原菌的分离和鉴定

通过对死于出血性肠炎的圈养鹿的病原菌进行分离鉴定,为研制产气荚膜梭菌β-毒素单价和多价疫苗奠定基础。采集山西省内不同地区鹿场因出血性肠炎而死亡鹿的病料32例,经病原微生物分离培养、生化试验和血清型鉴定,分离得到C型产气荚膜梭菌,并测定分离菌所产毒素对小鼠的最小致死量。PCR扩增C型产气荚膜梭菌β-毒素基因,构建重组质粒p MD18-T-J28-C,进行酶切鉴定和核苷酸序列分析。结果 32株分离菌中有6株是C型产气荚膜梭菌,占18.7%;其余均为A型,占81.3%。筛选出毒力最强的菌株J28-C,最小致死量(MLD)为5.0×105CFU/m L。PCR扩增和核苷酸序列分析表明,经PCR得到了特异性的β毒素基因片段。表明造成山西省鹿出血性肠炎的病原菌为A型和C型产气荚膜梭菌,以A型为主。     

一株猪源产气荚膜梭菌分离、鉴定及药敏试验

<正>产气荚膜梭菌,根据产毒素能力分为A、B、C、D和E 5个血清型。一般认为C型菌株是导致2周龄内仔猪肠毒血症和坏死性肠炎的主要病原,而A型菌株则与哺乳及育肥猪肠道疾病有关[1]。因此,猪产气荚膜梭菌病主要由A型、C型产气荚膜梭菌引起各种年龄阶段的猪发生一种急性、致死性肠道传染病。产气荚膜梭菌除了引起1周龄仔猪发生的高度致死性、坏死     

云南省曲靖市家畜猝死症的病原分离与鉴定

对云南省曲靖市近年流行的家畜猝死症进行了流行病学调查、临床症状观察、病理剖检，并对先后采自7个县(市)区的24份病料进行了病原分离、动物接种试验、生化鉴定、肠毒素定型及药敏试验。共分离到细菌24株，其中产单核细胞李氏杆菌20株，A型产气荚膜梭茵2株，C型产气荚膜梭菌2株。采取相应的综合防治措施后，2003年冬到2004年春夏再未发生新的疫情。     

牛出血性肠炎A型产气荚膜梭菌的分离鉴定

从新疆维吾尔自治区某牛场采集的3份疑似出血性肠炎病料中分离到8株产气荚膜梭菌,用PCR扩增保守基因16SrRNA,并进行序列测定和同源性分析,再通过多重PCR方法扩增型特异性基因进行分离菌株的分型鉴定。结果显示,所分离的8株产气荚膜梭菌之间16S rRNA基因同源型为100%,与GenBank参比序列同源性在99.8%以上,确定为产气荚膜梭菌。遗传进化分析表明,本次分离的8株产气荚膜梭菌之间拥有共同起源,但与所用的参考菌株分属不同来源。多重PCR扩增结果显示,8株菌株均为产气荚膜梭菌A型。     

羊源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定与进化树分析

无菌采取内蒙古通辽市某羊场病死羊肠道内容物、肝脏和肺脏,进行细菌的分离培养。将从十二指肠内分离到的1株疑似致病菌株进行生化试验、小鼠致病性试验,再将其通过魏氏梭菌多重PCR试验、魏氏梭菌ELISA试验及16S rRNA PCR试验进行鉴定。将PCR产物进行测序并进行了16S rRNA基因的进化树分析。结果显示,经细菌生化试验、多重PCR试验、ELISA试验和16S rRNA试验均证实此分离株为A型产气荚膜梭菌;进化树分析显示该菌与序列号为HQ808749.1(美国)的A型产气荚膜梭菌遗传距离最近。结果表明,该羊病例所分离的致病菌为A型产气荚膜梭菌。     

产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌表达产物的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）经动物试验证实没有毒性。从ＩＰＴＧ诱导后的工程菌中提取包涵体,再辅以氢氧化铝胶制成抗原,免疫小鼠３０ｄ后,用产气荚膜梭菌强毒株培养上清及培养菌体攻击,结果免疫鼠能抵抗至少２ＬＤ１００的攻击,证明Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）工程菌株表达产物具有良好的免疫原性。     

牛羊4种寄生虫病联合诊断技术的研究与应用

疫区牛羊同时寄生有捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫等多种寄生虫。目前血清学诊断方法对这 4种寄生虫病的检测需 2～ 4次操作。将捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫抗原分别以 0 1 5 ,0 0 4 ,0 0 6和 0 1 3μg/ μL的最佳浓度依次定点在同一硝酸纤维素膜条上 ,制成 4种寄生虫病联合诊断膜。用黄牛IgG ,水牛IgG和山羊IgG联合免疫兔 ,获得了高效价兔抗黄牛、水牛和山羊 (简称兔抗牛羊 )IgG抗血清。应用兔抗牛羊IgG抗血清连接酶标SPA ,建立了 1份血纸能同时用于检测牛、羊捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫病抗体技术。经浙江、湖北、四川、安徽等省应用 ,该项技术具有省工、省时、经济、实用等优点。适宜于牛、羊捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫病流行区的普查或监测     

兔产气荚膜梭菌SD12株的分离与血清型鉴定

从山东某兔场病死兔中分离到一株致病菌,经厌氧培养、菌落形态学观察、培养特性、生化反应、小白鼠毒力试验、动物回归试验、分子生物学试验,结果表明,该病原菌为厌氧菌,对小白鼠和家兔具有强致病力,为A型产气荚膜梭菌,并命名为SD12株。     

检测K88~+肠毒素性大肠杆菌PCR方法的建立

以K8 8菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了一对可扩增长 2 0 1bp的目的片段的引物 ,成功地建立了检测肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88菌毛基因的PCR方法。进行了PCR方法的特异性试验和敏感性试验。对K99+ ,F41 + ,987p+ 参考菌株和鼠伤寒沙门氏杆菌 ,链球菌 ,金黄色葡萄球菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该检测方法的敏感度可达 1 0个细菌。用此方法对 1 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,结果有 2株阳性 ;与血清学检测的结果一致。结果表明此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床K88+ 肠毒素性大肠杆菌病的快速诊断和流行病学调查     

猪链球菌2型与麦氏弧菌的分离鉴定及动物致病性试验

从 1 999年夏江苏省某地暴发的猪急性败血型病死猪脏器中 ,分离到RGR990 1、RGR990 2、RGM990 3、RGM990 4 4株细菌。经病原学鉴定 ,RGR990 1、RGR990 2为猪链球菌 2型 ,RGM990 3、RGM990 4为麦氏弧菌。对其进行致病性研究发现 ,所分离的 2株猪链球菌 2型在实验室条件下对猪仅产生一过性体温升高 ,不致死 ;麦氏弧菌对猪无致病性。将二株猪链球菌 2型及麦氏弧菌混合培养物分别同时接种猪 ,则可使猪体温迅速升高 ,并于 2 3h内死亡 ,二者表现出明显的协同致病作用     

γ-氨基丁酸等药物对日本血吸虫运动性的影响

采用肉眼观察法测定有关药物对日本血吸虫运动性的影响。结果表明：（１）１０－３,１０－４,１０－５ｍｏｌ／Ｌγ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）均有兴奋虫体的作用,其兴奋性随浓度递增而增强;（２）用１０－３、１０－４ｍｏｌ／Ｌ巴氯酚（ｂａｃｌｏｆｅｎ）、毕扣扣林（ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ）和印防己毒素（ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）作用虫体后,巴氯酚、毕扣扣林在浓度为１０－３ｍｏｌ／Ｌ时对虫体有明显抑制作用,浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ时抑制作用不明显;而１０－３、１０－４ｍｏｌ／Ｌ印防己毒素均表现一定的兴奋作用;（３）先用１０－３ｍｏｌ／ＬＧＡＢＡ兴奋虫体后,再加入上述药物,结果仍是相同。表明一定浓度的巴氯酚,毕扣扣林不仅对内源性的ＧＡＢＡ有拮抗作用,而且对外源性的ＧＡＢＡ有拮抗性;而印防己毒素不仅无拮抗性,还有协同ＧＡＢＡ的兴奋作用。初步判定,ＧＡＢＡ为日本血吸虫的一种兴奋性神经递质,有别于其它寄生虫（如曼氏血吸虫和鸡蛔虫）。     

鸡大肠杆菌Ⅰ型菌毛亚单位苗交叉保护的初步研究

含Ⅰ型菌毛的３ 个不同血清型（Ｏ１ 、Ｏ７８ 及Ｏ８８） 的菌株， 大容量培养后提取菌毛制备３ 种单价菌毛油乳苗。用１ 日龄雏鸡分别免疫３ 种单价菌毛油乳剂苗， 每雏免疫量为１２５ μｇ ， 隔离饲养至２ 周龄经气囊攻毒， 并评价疫苗的免疫原性。结果未免疫鸡出现８７－５ ％ ～１００ ％ 的死亡率， 免疫鸡用同源菌株攻毒后死亡率仅１２－５ ％ ， 用异源菌株攻毒出现３７－５％ ～６２－５ ％ 的死亡率。免疫鸡攻毒后未死亡者， 经扑杀观察， 可见在气囊、心包及肝脏的病变非常轻微， 且攻毒后比非免疫鸡能更有效地清除攻入气囊的大肠杆菌     

PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测     

草粮轮作与农田生态平衡——兼论 Ladino 白三叶的生态经济效益

利用无性繁殖法定植Ｌａｄｉｎｏ白三叶（Ｔｒｉｆｏｉｕｍｒｅｐｅｎｓ）和雅安逸生白三叶（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ），地上部生物量前者比后者表现出极显著差异；地下部生物量和贮氮量表现为显著差异。后作玉米产量，Ｌａｄｉｎｏ白三叶地为６．２９ｔ／ｈａ大于雅安逸生白三叶地（６．１５ｔ／ｈａ）；农田生态系统里前者表现为正氮平衡，后者表现为负氮平衡，前者土壤固相、液相和气相比为１∶０．５∶０．２５明显优于后者；前者Ｃ／Ｎ比适中，后者Ｃ／Ｎ过窄，其抗性雅安逸生白三叶低于Ｌａｄｉｎｏ白三叶。三种种子直播的豆科牧草的生态经济特性表现为南苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏｈｉｓｐｅｄａ）大于苕子（Ｖｉｃｉａｃｏｒａｃｃａ），紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓ）则介于两者之间。草粮轮作周期证明，Ｌａｄｉｎｏ白三叶和南苜蓿以及苕子是无性繁殖和有性繁殖的最佳材料，值得广泛推广利用。     

水牛感染肝片吸虫后肝脏组织的病理学变化

15 头水牛在人工感染条件下进行肝片吸虫感染, 慢性感染组水牛每天口服60 个囊蚴, 20 d 总共口服1 200 个囊蚴。急性感染组水牛1 次口服1 600 个囊蚴。慢性感染的水牛于感染后第26 周宰杀。急性感染的水牛分别于第10 , 13 , 16 和22 周宰杀。肝脏的组织病理学显示, 肝片吸虫幼虫可引起肝脏一系列炎症反应。急性感染后第10 周和13 周肝细胞变性、坏死, 肝小叶内淤血, 大量淋巴细胞浸润, 继而发展为肝索萎缩。急性感染后第22 周及慢性感染后第26 周, 汇管区内有大量结缔组织及新生的小胆管增生。实验表明慢性感染和急性感染肝片吸虫的水牛均可导致肝脏典型的病理学变化。