鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗（La Sota株＋M41株＋L株）

青岛澳兰百特生物工程有限公司自2004年成立了科技攻关小组,开始了对鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型三联灭活疫苗（La Sota株＋M41株＋L株）【以下简称新-支-流（H9亚型）】的研究工作。经过不懈的努力,终于完成了对该三联灭活疫苗制苗用毒种的筛选、安全性鉴定、免疫原性鉴定、代次控制,以及三联灭活疫苗的生产工艺研究、安全和效力检验、免疫剂量、免疫期、保存期试验、中间试制等工作,并进行了临床试验,积累了必要的试验数据,取得了详实的研究结果。     

鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验

用NDV分离株及La Sota株为抗源液，经福尔马林灭活后，与油佐剂混合，分别制成分离株灭活苗、La Sota株灭活苗及分离株与La Sota株二价灭活苗。将这三种灭活疫苗分别免疫SPF鸡后，均获得100%抵抗NDV分离株及F48株强毒攻击的保护力；而用这3种灭活苗与La Sota活苗单独或联合使用，免疫带有ND母源抗体的普通鸡后，3种灭活苗的免疫效力不同，分离株灭活苗与价灭活苗对NDV分离株攻击的免疫保护效力明显优于La Sota灭活苗；灭活苗与活苗同时使用，其免疫效力明显优于单独使用灭活苗或活苗。     

新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究

为研究新城疫病毒(NDV)La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株在低免疫鸡胚中进行同胚接种培养的可行性,通过将不同稀释倍数的La Sota株和M41株接种同一低免疫鸡胚,分别测定收获尿囊液La Sota株和M41株含量,确定最佳的稀释倍数以及适宜的培养温度和培养时间。结果显示:La Sota株和M41株以10 000∶5 000的比例稀释,培养96 h病毒含量和收获量最佳,La Sota株含量可达到109.17EID50/0.1 m L,HA效价为1∶1 024,M41株含量可达到106.50EID50/0.1 m L。接种后孵育温度为36.5℃时,每胚收获量比37℃培养增加了1.0～1.2 m L。按照此工艺生产病毒制备疫苗免疫SPF鸡,NDV和IBV抗体均符合国家标准要求。试验探索并优化了La Sota株和M41株在低免疫鸡胚中同胚接种的培养条件,为大规模抗原生产提供数据支持。     

鸡新城疫(La Sota株)浓缩油乳剂灭活疫苗的研究

鸡新城疫（ND）对幼龄鸡和育成鸡均危害较大，免疫接种是控制新城疫的主要手段，而常规的灭活疫苗接种剂量大，产生抗体水平低，易造成鸡群的应激反应。为了解决此问题，进行了鸡新城疫浓缩油乳剂灭活疫苗的研究，现将研究情况报道如下。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株、T株生物学特性的研究

<正>鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变。不同性别、品种和年龄鸡均易感,但主要侵害1~4周龄幼鸡[1]。IB呈全球性分布,自1972年我国学者邝荣禄首先在广东省报道IB以来,全国开始陆续报道IB的流行,该病是继鸡新城疫、马立克、鸡传染性法氏囊病之后的又一严重危害我国养禽业的主要传染病[2]。国     

影响鸡新城疫（La Sota株）活疫苗抗原病毒含量因素的探讨

鸡新城疫（La Sota株）活疫苗抗原病毒含量受多种因素的影响,如种蛋的母源抗体、种毒的病毒含量、照蛋间隔时间、抗原保存时间、抗原保存温度等。文中主要针对以上因素进行试验,结果表明：在相同条件下用含新城疫母源抗体越高的种蛋制备的（La Sota株）活疫苗抗原的病毒含量越低;使用病毒含量高的种毒制备的抗原病毒含量高于使用...     

鸡毒支原体对NDV La Sota株免疫应答的影响

以鸡毒支原体NB72株或和R株对鸡先行人工感染,然后,与无支原体感染的对照鸡同样接种NDV La Sota株,观察NDV免疫应答动态。结果,支原体感染鸡群血清和气管中的NDV血凝抑制抗体效价,虽然比未接种支原体的鸡群低.但二者差异不显著(P>0.05).随后,通过攻击NDV强毒,不论先前经过或未经过支原体人工感染,ND免疫鸡全部被保护,且血清中NDV HI抗体效价均大幅度升高;未经ND免疫接种的对照鸡全部发病死亡,因此,鸡毒支原体NB72株或R株感染的鸡对NDV La Sota株的免疫应答无明显改变。最后就体内试验的结果进行了讨论。     

NDV La Sota株、V4株F蛋白表位的预测

为进一步研究2种疫苗的表位,以深入探讨NDV La Sota株、V4疫苗免疫差异的根本所在。应用亲水性、可及性、抗原性、可塑性和二级结构预测等5种参数分别对新城疫病毒La Sota株和V4株F蛋白的B细胞抗原表位进行了综合预测,预测到二者的B细胞抗原表位分别有19个,这些表位中含有已经确定的5个中和表位,A1：72aa,A2：78aa,A3：79aa,A4：157aa、161aa、170aa、171aa,A5：343aa。比较发现,二者有9个预测的B细胞表位氨基酸序列存在差异。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)应用效果研究

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(三联苗(Re-9株))为国内首个采用基因重组H9亚型禽流感疫苗株研制的新支流三联灭活疫苗。为研究疫苗上市后的实际应用效果,使用7日龄AA肉鸡和260日龄产蛋期蛋鸡评价三联苗(Re-9株)有效性。结果显示:肉鸡免疫后14 d即可激发抗体,免疫后21 d,新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)的血凝抑制(HI)抗体分别达8.6log2、6.2log2、8.3log2,出栏时仍维持在较高水平;于免疫后14 d抽样进行NDV、H9 AIV攻毒,对照组均100%发病或排毒,免疫鸡均可获得100%保护;在蛋鸡上,免疫三联苗(Re-9株)后28 d,NDV、IBV、H9 AIV的HI抗体效价分别达12.0log2、7.8log2、12.2log2,免疫后6个月仍可以维持在较高水平。结果表明:三联苗(Re-9株)在实际应用中免疫效果较好,本研究将为鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的防控提供有力支撑。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活 疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫程序研究

设计不同的免疫程序,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡,通过对ND、IB、H9抗体滴度监测,探讨ND、IB、H9抗体消长规律及鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)的免疫程序。试验结果表明,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡后,其诱导产生的ND、IB、H9抗体的消长规律基本同步;仅于10日龄免疫一次三联灭活苗,其抗体水平较低,于20、40日龄二免、三免或10日龄先用鸡新城疫病毒(La Sota株)、禽流感病毒(H9亚型,SS/94株)二联灭活疫苗作基础免疫,20或40日龄再用三联灭活苗作加强免疫,则上述3种抗体均快速上升,且维持时间长。根据试验结果,建议按照正常免疫程序作基础免疫的健康肉鸡,饲养期较短的可于20日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.3 mL/只;饲养期较长的则于40日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.5 mL/只。     

不同鸡传染性支气管炎疫苗毒株对新城疫La Sota株的增殖干扰试验

为观察IBV不同疫苗毒株H120、H52、4/91、28/86、Ma5及W93株对NDV增殖的干扰作用,采用不同浓度的IBV疫苗毒株与NDV La Sot a毒株分别按不同顺序接种,同胚增殖。利用血凝试验(HA)测定NDV效价,以判断IBV对NDV的干扰作用,为同胚增殖两种病毒提供参考数据。试验结果表明,IBV不同疫苗毒株能干扰NDV La Sot a增殖,干扰作用与其接种顺序、接种浓度及收毒时间有关。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株鸡胚增殖工艺研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41标准毒株在鸡胚上的最佳生产工艺,试验用IBV M41株分别以不同剂量接种同一胚龄不同鸡胚、不同胚龄普通鸡胚,以及IBV M41株接种普通鸡胚后不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备病毒液的产量及病毒效价。结果显示:IBV M41株接种无传染性支气管炎病毒母源抗体的SPF鸡胚最佳病毒接种剂量为104.5EID50,接种含有IBV母源抗体的普通鸡胚最佳病毒接种剂量为105.1EID50,最佳接种胚龄为11日胚龄,最佳收毒时间为48 h。按照此工艺制备疫苗,免疫SPF鸡,IBV抗体效价均符合规程标准。研究结果为用鸡胚高效、大量生产IBV M41株病毒抗原进而生产合格的IB疫苗提供了数据支持。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10~(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。     

NDV地方分离株与La Sota株抗原交叉性研究

用新城疫弱毒疫苗株La Sota阳性血清测定NDVMM，NDVLD，NDV-NH3株新城疫病毒地方分离株和标准株La Sota，F48E9的HI效价，以La Sota阳性血清对La Sota疫苗株的HI效价为参照，分析NDV地方分离株与疫苗株抗原交叉性。结果表明，NDV-MM，NDV-LD 2个野毒株HI效价与NDV-LD HI效价相近，但比La Sota HI效价低2．3个～2．7个滴度；NDV-NH与F48E9 HI效价相近，比La SotaHI效价低4．2个～4．3个滴度，提示以上3个野毒株与疫苗株之间的抗原相关性差异较大。动物免疫保护试验结果表明，经La Sota免疫（HI效价〉2^5）后攻毒保护率为80％-100％。     

鸡滑液支原体灭活疫苗（YBF-MS1株）的临床应用效果

为了解鸡滑液支原体灭活疫苗（YBF-MS1株）的临床应用效果，分别对未免疫和免疫2次YBF-MS1疫苗后种鸡的产蛋率、孵化率、后代呼吸道和腿病发生率以及商品蛋鸡的产蛋下降率和破蛋率进行比对和分析。结果显示：免疫2次YBF-MS1灭活疫苗后，种鸡产蛋率提高1.2%~15.8%，种蛋孵化率提高0~7.3%，后代发病率降低16.7%~75.0%；商品蛋鸡产蛋下降率改善16.7%~100%，破蛋率下降25.0%~100%。结果说明：YBF-MS1灭活疫苗对滑液囊支原体（MS）感染具有较好的保护效果，可显著提高种鸡产蛋率、种蛋孵化率，降低商品代鸡的发病率，同时减少商品蛋鸡顶端异常综合征（EAA）的发生。本研究为科学评价滑液支原体灭活疫苗（YBF-MS1株）的临床应用效果提供了数据支撑。     

鸡传染性支气管炎病毒D971分离株与M41株、T株接种鸡的病理形态学比较研究

鸡传染性支气管炎病毒D971分离株感染SPF鸡后主要表现为消瘦、稀便、伴有轻微的呼吸症状；剖检可见腺胃乳头肿胀、充出血、或乳头凹陷，并附有大量黏液；组织学观察可见腺胃黏膜上皮和固有层有坏死、脱落或溃疡，个别病例见有淋巴样细胞浸润，肌胃黏膜有中度坏死，伴有少量淋巴样细胞浸润，实质器官细胞变性、坏死，脾、胸腺及法氏囊的淋巴细胞有较为明显的坏死。M41株和T株感染SPF鸡后，其腺胃变化不明显。     

鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)的灭活试验

为了研究鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)中两种病毒的最佳甲醛灭活浓度和灭活时间,试验选取四种甲醛最终浓度0.1%、0.2%、0.4%、0.8%,分别对两种抗原进行灭活,在灭活10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36h、42 h分别取样,对每个样品进行灭活检验和血凝价测定。从试验结果得出,新城疫病毒(La Sota株)最适合的甲醛浓度为0.1%,灭活时间为16 h;禽流感病毒(H9亚型HP株)最适合甲醛浓度为0.1%,灭活时间为18 h。     

鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W93株二联活疫苗研究Ⅱ.接毒剂量选择试验

将鸡新城疫La Sota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后，将两种病毒液等量混合，接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明，HBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象；收获的鸡胚液(La Sota W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。     

新城疫病毒La Sota株的溶肿瘤性特性评估

试验通过检测病毒对癌性(Hep2C)和非癌性(MRC-5)细胞系的影响来确定NDV的溶肿瘤效率。用NDV La Sota株感染这些细胞系。在两个细胞系中都观察到了CPE,但是Hep2C细胞系发现严重的细胞损伤。在不同的时间间隔进行细胞计数,大约有98%的Hep2C细胞不能存活。95h后,仅有40%的MRC-5细胞没有活力,将这些细胞进行重新传代,发现仍然会有吸附现象出现。     

鸡新城疫耐热保护剂活疫苗(La Sota株)保存期试验

本实验将NDV La Sota株耐热保护剂活疫苗分别放入37℃、常温、2~8℃进行NDV La Sota株耐热保护剂活疫苗保存期试验。在37℃保存7d、10d、15d,将疫苗分别取出,进行病毒含量测定、性状检验。在常温保存10d、20d、30d,将疫苗分别取出,进行病毒含量测定、性状检验。在4℃保存9、12、15、18、24、27个月,按规定日期取出疫苗,进行疫苗的效力检验及外观性状检验。最后得出结论:耐热保护剂活疫苗可在2~8℃保存24个月。