犬瘟热病毒在不同组织细胞上增殖特性的研究

将犬瘟热病毒(CDV)分别接种于长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)、非洲绿猴肾细胞系(Ve-ro)、犬肾细胞系(MDCK),观察其病变时间、病变特征,并对其进行RT-PCR鉴定和TCID50测定。结果表明,CDV在这3种细胞上均能增殖,并产生明显的细胞病变(CPE),但在Vero细胞上产生病变的时间短,病变明显,且TCID50最高;RT-PCR检测CDV在不同细胞上的病毒培养液,均能扩增出337bp的片段;CDV在Vero细胞上的增殖滴度明显高于在CEF、MDCK细胞上的增殖滴度。表明本试验所选用的3种细胞中,Vero细胞最适宜培养CDV,所获得的CDV的毒价最高,病变最明显。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株的分离与鉴定

从河南省某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该病毒能在 Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变 (CPE),在 Vero、PK-15细胞上不出现CPE.该病毒能被猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清特异性地中和,用 PCR反应能扩增出 720 bp的特异性片段.分离病毒回归 30日龄仔猪可出现高热和呼吸道症状.初步鉴定该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒.     

Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用

Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。     

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明：ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1-R株)微载体悬浮培养工艺研究

为了建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的Marc-145微载体细胞悬浮培养工艺以提高HPPRRSV抗原效价,以BC-7L生物反应器微载体悬浮培养Marc-145细胞,对HP-PRRSV接毒时间、接毒剂量、维持液血清浓度、溶氧量参数、病毒增殖温度等工艺参数进行了摸索和优化。通过细胞悬浮培养逐级放大工艺,在BC-100L生物反应器中培养Marc-145细胞,以优化后HP-PRRSV悬浮培养工艺进行3个批次的病毒悬浮培养。结果在Marc-145细胞微载体悬浮培养的第4天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1的剂量接毒,接毒后以2%新生牛血清的维持液进行维持培养,溶氧参数设置为40%,最佳培养温度为37℃,最佳收获病毒时间为70~74 h。BC-100L生物反应器中培养的3批病毒增殖曲线与BC-7L培养的病毒增殖曲线相近,在接毒后72 h左右达到病毒效价高峰,病毒含量均不低于108.0TCID50/m L。表明HP-PRRSV悬浮培养工艺稳定,可以实现逐级放大、规模化生产。     

犬瘟热病毒在Vero细胞上培养条件的优化研究

犬瘟热病毒(CDV)在Vero细胞上增殖条件研究结果表明，血清含量5％，2倍的细胞密度，24h接毒，48～96h有利于CDV的增殖。     

水貂犬瘟热病毒LD-1株的分离与鉴定

取山东某貂场疑似犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）感染的水貂肝脏等组织病料,通过RT-PCR检测呈CDV阳性,且无水貂细小病毒存在,将病料接种原代CEF细胞、传代系Vero细胞和DF1细胞3种细胞进行病毒分离,通过优化细胞培养条件,最终在Vero细胞上传代培养成功,出现露珠状典型细胞病变（CPE）。分离毒应用RT-PCR、PCR产物测序、抗体中和试验（SN）、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒包涵体检查等多种方法进行了CDV的鉴定,结果显示CDV阳性,表明分离到的病毒为水貂CDV,并将其命名为CDV LD-1株。     

两种传代细胞增殖伪狂犬病病毒弱毒株抗原效价的比较

文章通过比较试验,筛选到一株适合PRV Bartha-K61株增殖的PK-15细胞,病毒效价明显高于Marc-145细胞培养和现行的鸡胚成纤维细胞培养,为下一步研制和开发传代细胞源PRV疫苗奠定了技术。     

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287 bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%~96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%~99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。     

猪蓝耳病病毒CH-1R株高敏感性Marc-145细胞株的克隆与产毒试验

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞.为了进一步提高PRRSV CH-1R弱毒疫苗株在Marc-145细胞中的增殖水平,试验采用有限稀释法对Marc-145细胞进行克隆.结果表明,克隆后获得的Marc-145/D2细胞株对CH-1R弱毒株具有更高的敏感性.     

The growth profiles of three types of canine distemper virus on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule

To know growth profiles of canine distemper virus (CDV) on Vero cells stably expressing canine signaling lymphocyte activation molecule (Vero-DogSLAMtag; Vero-DST cells), the propagation of three strains of CDV was tested in Vero-DST cells in comparison with parental Vero cells. Strain MD77 could grow well in both cell lines, but demonstrated no syncytium formation or indistinguishable rounding cytopathic effects (CPE) in Vero cells. Strains Onderstepoort and KDK-1 also grew well in Vero-DST cells with apparent syncytium CPE, while they grew less or no efficiently, respectively, in Vero cells. All three CDV strains demonstrated the peak titers, in Vero-DST cells before reaching to an extensive CPE and drastic decrease of titers at/after full CPE. Immunohistochemistry revealed that viral antigens of all CDV strains were found exclusively in the syncytia in Vero-DST cells, while in Vero cells, viral antigen was identified in their single cells for strain MD77 but none for other strains. Thus, every strain of CDV could grow well in Vero-DST cells and behaved differently against Vero cells. These results would be of practical value for workers of CDV because 1) In Vero-DST cells, by observation of distinct syncytium CPE, the highest titer or the best growth of virus could be identified; 2) In Vero cells, various CDV strains could be readily classified after propagation in Vero-DST cells.     

CDV免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体的消长规律及其相关性分析

为了解产蛋鸡对犬瘟热病毒杭原的免疫反应及其血清抗体和卵黄抗体的消长规律及相关性,为制备卵黄抗体提供依据,将犬瘟热病毒接种Vero细胞和DF1细胞进行传代并测定其病毒滴度,选取细胞病变出现早,病毒滴度高的Vero细胞毒作为接种病毒抗原免疫蛋鸡。通过每10d进行蛋鸡免疫一次,四免后每30d加强免疫一次的方法进行免疫。免疫前和免疫后每10d采血分离血清和每5d收集鸡蛋提取卵黄抗体,用琼脂扩散法和间接ELISA法测定其抗体水平。结果显示,血清抗体比卵黄抗体的滴度高,两者间呈正相关性,卵黄抗体出现较血清抗体迟3～5d,卵黄抗体在三免后3～5d就已达到较高水平,此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。     

犬瘟热病毒免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体消长规律的研究

试验旨在了解产蛋鸡对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)抗原的免疫反应及其血清抗体和卵黄抗体的消长规律,为制备卵黄抗体提供依据。将CDV接种Vero细胞和DF1细胞进行传代并测定其病毒滴度,选取细胞病变出现早、病毒滴度高的Vero细胞毒作为接种病毒抗原免疫蛋鸡。每10 d免疫蛋鸡1次,第4次免疫后每30 d加强免疫1次。免疫前及免疫后每10 d采血分离血清,每5 d收集鸡蛋提取卵黄抗体,用琼脂扩散法和间接ELISA法测定其抗体水平。结果显示,血清抗体比卵黄抗体的滴度高,两者呈正相关性,卵黄抗体出现较血清抗体迟3~5 d,卵黄抗体在第3次免疫后3~5 d就已达到较高水平,此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。     

应用流式细胞术研究犬瘟热病毒感染细胞的凋亡

用犬瘟热病毒 ( CDV) 2种不同毒株感染非洲绿猴肾细胞 ( Vero) ,用流式细胞术分析了病毒诱导的感染细胞的凋亡。结果发现 ,2种毒株感染引起的细胞病变类型不同 ,分为圆缩型与合胞体型 ;2种毒株均可诱导感染细胞凋亡 ,但毒株间的凋亡细胞比例存在差异 ,即产生合胞体型细胞病变的毒株凋亡出现较晚 ,凋亡细胞比例显著低于产生圆缩型细胞病变的毒株 ( P<0 .0 1 )。结果提示 ,不同毒株导致细胞死亡的机制可能不同     

贵州犬瘟热病毒的分离鉴定

对流行病学调查、临床症状检查和ELISA检测为犬瘟热阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法接种于犬肾细胞系(MDCK)进行病毒的分离,并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明:病料接种MDCK细胞产生明显的细胞病变(CPE),电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的犬瘟热病毒粒子。分离株不凝集鸡及人“O”型红细胞,接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为760 bp,与预期设计的长度相同,由此确证分离株为犬瘟热病毒,命名为CDV-GZ2株。     

In vitro propagation of canine distemper virus: establishment of persistent infection in Vero cells

Primary cultures of bovine fibroblast (BF) and canine brain cells, persistently infected with virulent R252-canine distemper virus (CDV), were cocultured with African green monkey (Vero) cells. Transfer of persistent CDV from BF to Vero cells varied inversely with the in vitro passage level (age) of the CDV-infected BF cells. Successful transfer of CDV to Vero cells was signaled by the transient appearance of viral syncytia, rapid spread of viral antigen to all Vero cells in the culture, and by recovery of cell-free Vero-infectious virus in culture fluids. With time, viral cytopathic effects in Vero cells containing CDV disappeared, and the infected lines could not be distinguished from noninfected control Vero cells, except by immunoassay for viral antigen.     

犬瘟热病毒的分离及部分特性研究

本试验通过消除组织培养中某些干扰因素,用鸡胚成纤维细胞(CEF)直接从水貂病料中分离出3株犬瘟热病毒,即QM—CDV、YM—CDV和ZM—CDV,并以3株国外犬瘟热弱毒作为参考株,对所分离毒株的部分生物学特性进行了研究.结果表明,QM—CDV、YM—CDV和ZM—CDV在鸡胚成纤维细胞上生长良好,产生明显的细胞病变(CPE),也可在猴肾传代细胞(Vero)和人羊膜细胞(FL)上增殖并出现细胞病变;在电镜下观察,病毒粒子具有囊膜和纤突,直径在130～180nm之间;细胞中和试验表明,分离毒与国外弱毒具有相同的血清型;分离毒株的水貂病料经脑内接种均使幼犬发病,出现明显的临床症状.     

Expression,Identification and Subcellular Localization of V Protein of Canine Distemper Virus

In order to study the function of canine distemper virus (CDV) V protein,V gene fragment was inserted into the pGEX-6p-1 vector,and then pGEX-6p-1-CDV-V recombinant expression plasmid was obtained.Purified V protein immunized BALB/c mice to prepare the positive serum.Meanwhile,to confirm the distribution of V protein and subcellular localization with confocal laser technology,a eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was built,then transfected into Vero cells.The results showed that V protein was successfully expressed and the positive serum was prepared.The recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was expressed in Vero cells and mainly expressed in cytoplasm.The results laid a function for functional studies of CDV V protein.