家蚕微孢子虫保存株DNA的特异性扩增

尝试研制成了一种微孢子虫检测的新系统。以家要微孢子虫小亚单位rRNA基因的推导假基因及保守序列为引物,对家蚕微孢子虫(Nosemabombycis.Nb)保存株的DNA进行了特异的PCR扩增。检测了六株微孢子虫:三株为家蚕微孢子虫株系,即保存株SES—NU、NIS—001和分离自草地贪夜蛾(Spodoptera depravata)的株系Sd—NU—IW8401;及三个种:Nosema Sp.株NIS—Mll,变形孢子虫属的分离株Vainmorpha Sp.NIS—M12和具褶孢子虫属分离株Pleistoophora Sp.PI—NU,以此六株微孢子虫的DNA为模板进行PCR扩增,仅家蚕微孢子虫(Nb)的保存株SES—NU、NIS—001获得扩增产物。     

多重引物PCR特异性扩增微孢子虫DNA片段

利用几种引物的混合物,检验多重引物PCR早期检测不同种类家蚕传染性微孢子虫的适用性。结果是:当用目的微孢子虫的基因组DNA作为DNA模板时,用本研究设计的多重引物进行PCR可以扩增出特异性DNA片段。而当采用家蚕或其他微生物的基因组DNA作为DNA模板时,没有获得PCR产物。另外,只有当家蚕被各种微孢子虫感染时,多重引物PCR才能扩增出特异性ONA片段。当从受到家蚕微孢子虫感染的蚕卵中抽提基因组DNA作为DNA模板时,采用多重引物PCR也可以扩增出特异性DNA片段。从受家蚕微孢子虫感染的家蚕中抽提基因组DNA作为DNA模板时,也可以得到类似的结果。这些发现说明本研究设计的多重引物PCR适合用于蚕种微粒子孢子感染性检验。     

PCR和核酸杂交检测家蚕微孢子虫的研究(摘报)

<正> 以家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、柞蚕微孢子虫(Nosema sp.,柞Nb和柞NB)、讷卡变形微孢子虫(Vairimorpha necatrix)、金鱼具褶微孢子虫(Pleistophora anguil-larum)等18种(株)微孢子虫的基因组DNA为模板,设计一对引物进行PCR扩增,及将PCR特异产物克隆后抽提纯化质粒制备成地高辛标记探针,对PCR和核酸杂交检测家蚕微孢子虫的反应体系和条件进行了探索性研究,结果如下:     

九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究

以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

多引物PCR检测家蚕卵微粒子病的新方法

利用几种PCR引物的混合物，评估多引物PCR是否可以实际应用于同时感染几种能导致家蚕微孢子病的微孢子虫的早期检测。从感染了家蚕微粒子病原虫（BmNb）的蚕卵中抽提的基因组DNA，并以此作为DNA模板，用多引物PCR扩增这种特异的DNA序列。此外，从感染了BmNb的家蚕中获得的基因组DNA作为DNA模板，也获得了相同的结果。这些发现表明用本研究设计的多引物PCR对蚕卵微孢子病的检查具有实用价值。     

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。     

玉米微孢子虫超微结构的观察与系统发育分析

玉米螟微孢子虫作为玉米螟田间种群自然控制因子之一,能否交叉感染家蚕,其与家蚕微孢子虫的血缘关系值得探究。通过对实验室搜集的家蚕微孢子虫和玉米微孢子虫进行了电镜水平的超微结构观察和分析,进而对它们的16S r DNA基因进行了PCR扩增、测序和系统发育分析,结果显示玉米微孢子虫与家蚕微孢子虫均属Nosema属,分别落在不同进化枝上的种,这可能暗示了玉米螟微孢子虫不能直接感染家蚕的部分缘由。     

两株微孢子虫:家蚕微孢子虫和新西兰草金龟微孢子虫的DNA探讨

从各自的微孢子虫基因组获得了两个能分别与家蚕微孢子虫和新西兰草金郇微孢子虫特异杂交的DNA片段,并对其进行了测序。尚没有发现该DNA片段能与供试的其它4个微孢子虫分别来自[蜜蜂微孢子虫、小菜粉蝶的变形孢虫(Vairimorpha sp.),新西兰草金龟和掘孔蛴螬(Wiseana sp.)的两株微孢子虫(Vavraia oncoperae)]的基因组DNA杂交。家蚕微孢子虫探针不与新西兰草金龟微孢子虫基因组DNA或与该微孢子虫原始昆虫寄主家蚕的DNA杂交。同样,新西兰草金龟微孢子虫探针不与家蚕秃孢子虫基因组或与新西兰草金龟的DNA杂交。两个DNA片段富含AT(分别占总碱基的59和79％),G+C/A+T的比率为0.70和0.25,表示其为散布于整个基因组中的重复序列。     

家蚕微孢子虫诊断新技术的研究

为了正确诊断家蚕微孢子虫(Nosema bobycis, N.b),共征集了11种微孢子虫作为诊断的材料。根据N.b.孢子(日本株)的DNA序列,设计一对引物,以N.b.DNA为模板进行PCR扩增得到一个约317bp的片段,将此片段克隆到大肠杆菌DH5 α中,提取重组质粒、酶切、回收目的片段,经地高辛标记为探针,对N.b.等11种微孢子虫DNA进行核酸杂交检测,只有N.b.DNA呈阳性反应。检测灵敏度均达到1ng DNA水平。     

实时荧光定量PCR检测柞蚕微孢子虫的方法

提高柞蚕微孢子虫检测技术的准确性和灵敏度,对控制柞蚕微孢子虫的胚种传染至关重要。以柞蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(SSU rRNA)基因为靶基因,建立柞蚕微孢子虫的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法能够特异性检测柞蚕微孢子虫基因组DNA,而对柞蚕基因组DNA无扩增产物。依据标准曲线确定荧光定量PCR的Ct值≤35作为检测的敏感度区间,对柞蚕微孢子虫基因组DNA的最低检出限为0.004 6 ng。应用该方法对100粒柞蚕蛹样本进行检测,共检出54个样本呈柞蚕微孢子虫感染阳性,而采用普通显微镜镜检与采用常规PCR方法检测呈阳性的样本数量分别为2个和34个。应用该方法对生产中的柞蚕种茧和雌蛾进行抽样检测,柞蚕微孢子虫感染阳性检出率显著高于用普通显微镜镜检的阳性检出率(P0.05)。建立的柞蚕微孢子虫实时荧光定量PCR检测方法提高了检测的灵敏度。     

环介导等温扩增法检测熊蜂中的微孢子虫

为快速检测进口熊蜂中的微孢子虫,建立了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplifi cation,LAMP)。针对熊蜂微孢子虫核糖体保守基因设计LAMP引物,以熊蜂微孢子虫DNA、家蚕微孢子虫DNA、蝗虫微孢子虫DNA、兔脑炎微孢子虫DNA作为LAMP反应的模板,分别采用浊度法和显色法验证LAMP引物的特异性;并将含微孢子虫基因的质粒模板10倍梯度稀释,考察方法的敏感性。结果表明,LAMP法能有效、特异地检测出熊蜂寄生微孢子虫DNA,灵敏度比PCR法高10倍。该方法简单、快速、敏感,可应用于熊蜂寄生微孢子虫的便捷检测中。     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒

基于为蚕种生产与流通贸易提供快速、灵敏、准确检测家蚕微孢子虫的方法,以家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因66 bp片段作为靶标,设计特异性引物和TaqMan探针,用构建的重组质粒制备标准品进行荧光定量PCR扩增,通过优化PCR反应体系,测定线性范围,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,成功构建了家蚕微孢子虫的荧光定量PCR检测方法,并研制出诊断试剂盒。该方法的检测线性范围为1×108～1×102拷贝/mL的7个线性梯度,检测家蚕微孢子虫的敏感度达1×102拷贝/mL,特异性高,3次重复性检测应用试验的批内变异系数为3.6%～7.2%,批间变异系数为5.2%～7.8%。结果表明,建立的家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法具有准确、灵敏、快速、特异性强的特点。     

多引物PCR法检测蚕卵的微粒子病的新方法

我们用多个PCR引物的混合物来评估多引物PCR法在早期诊断和多种微孢子虫同时感染家蚕的检测是否确实有效。当感染蚕微粒子病的蚕卵的DNA被提取出来做DNA模板时,用多引物PCR扩增某些特殊的DNA序列。     

家蚕微孢子虫的RAPD指纹图谱研究

用70个随机引物对家蚕寄生性微孢子虫的分子标记进行了RAPD扩增。结果:60％的引物产生了扩增多态性;随机引物OPG-11及OPH-08等可区分微孢子虫Nosema bombycis广州株及浙江株,Nosema sp.MG1和MG2、NI,柞Nb。结果表明:RAPD技术可作为区分微孢子虫种、亚种的一种手段。     

家蚕微孢子虫烯醇化酶(Enolase)基因的克隆及序列分析与原核表达

烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。     

不同DNA提取方法对隐孢子虫卵囊PCR检测的影响

为了提高隐孢子虫PCR检测的敏感性和效率,采用10种基因组DNA提取方法,对隐孢子虫卵囊DNA进行提取,对提取的DNA进行nested PCR扩增。经过3次重复试验,结果显示,Chelex 100法、FTA试纸法和Wizard DNAClean-Up System试剂盒法敏感性最高,能够稳定地扩增出1×10^2个卵囊提取的DNA,适合隐孢子虫病分子流行病学调查时大量样品DNA的提取。