家蚕微孢子虫保存株DNA的特异性扩增

尝试研制成了一种微孢子虫检测的新系统。以家要微孢子虫小亚单位rRNA基因的推导假基因及保守序列为引物,对家蚕微孢子虫(Nosemabombycis.Nb)保存株的DNA进行了特异的PCR扩增。检测了六株微孢子虫:三株为家蚕微孢子虫株系,即保存株SES—NU、NIS—001和分离自草地贪夜蛾(Spodoptera depravata)的株系Sd—NU—IW8401;及三个种:Nosema Sp.株NIS—Mll,变形孢子虫属的分离株Vainmorpha Sp.NIS—M12和具褶孢子虫属分离株Pleistoophora Sp.PI—NU,以此六株微孢子虫的DNA为模板进行PCR扩增,仅家蚕微孢子虫(Nb)的保存株SES—NU、NIS—001获得扩增产物。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

两种微孢子虫孢子表面蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

对来自家蚕的内网虫属样微孢子虫和家蚕微孢子虫的形态、表面蛋白及侵染性进行了比较研究。内网虫属样微孢子虫孢子显著小于家蚕微孢子虫 ,孢囊中孢子数为 8～ 32个 ,只侵染中肠组织 ,对家蚕无胚胎传染性。SDS UreaPAGE和 2D PAGE图谱显示两种孢子表面蛋白有明显差异。在SDS UreaPAGE中 ,内网虫属样微孢子虫的主要表面蛋白为 2 2kD ,而家蚕微孢子虫为 4 5kD。 2D PAGE显示 ,当上样量为 12 0 μg时 ,内网虫属样微孢子虫孢子表面蛋白斑点有 330多个 ,而家蚕微孢子虫孢子只有 16 0多个 ,其中仅有 10多个相同或疑似蛋白点。家蚕微孢子虫的主要表面蛋白点约有 2 0个 ,以中性偏酸的小分子居多 (<18kD ,pI 5 .4～ 7.2 ) ;内网虫属样微孢子虫有 30多个 ,分布较分散。根据两种孢子都能感染家蚕的特点 ,认为相同或疑似蛋白与是否能够感染有关 ,而大量差异蛋白与对家蚕的感染程度有关。两孢子表面蛋白中的主要蛋白均为差异蛋白 ,可能是孢子表面的结构蛋白。     

两株微孢子虫:家蚕微孢子虫和新西兰草金龟微孢子虫的DNA探讨

从各自的微孢子虫基因组获得了两个能分别与家蚕微孢子虫和新西兰草金郇微孢子虫特异杂交的DNA片段,并对其进行了测序。尚没有发现该DNA片段能与供试的其它4个微孢子虫分别来自[蜜蜂微孢子虫、小菜粉蝶的变形孢虫(Vairimorpha sp.),新西兰草金龟和掘孔蛴螬(Wiseana sp.)的两株微孢子虫(Vavraia oncoperae)]的基因组DNA杂交。家蚕微孢子虫探针不与新西兰草金龟微孢子虫基因组DNA或与该微孢子虫原始昆虫寄主家蚕的DNA杂交。同样,新西兰草金龟微孢子虫探针不与家蚕秃孢子虫基因组或与新西兰草金龟的DNA杂交。两个DNA片段富含AT(分别占总碱基的59和79％),G+C/A+T的比率为0.70和0.25,表示其为散布于整个基因组中的重复序列。     

一株家蚕病原性微孢子虫的生物学特性与分子系统发育分析

从家蚕体内分离得到一株新的病原性微孢子虫,编号为GXM1。光学显微镜下观察GXM1微孢子虫为长卵圆形,大小(1.85±0.15)μm×(4.19±0.18)μm,在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,发育速度缓慢,发育周期约8～10 d。GXM1微孢子虫与家蚕微孢子虫(Nb)的抗血清产生阳性凝聚反应。利用透射电子显微镜观察到GXM1微孢子虫的超微结构具双核,极丝11～12圈,极丝倾斜角约45°。以上生物学性状显示GXM1微孢子虫具有微孢子虫属(Nosema)的基本分类特征。依据GXM1微孢子虫与其它昆虫微孢子虫的SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及序列相似性和遗传距离分析,进一步证实GXM1微孢子虫属于Nosema属。GXM1微孢子虫对蚁蚕的半数感染浓度(IC50)为6.06×105mL-1,对家蚕的胚种传染率可达23.28%,是一株具有较强致病性和危害性的家蚕病原性微孢子虫。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。     

家蚕微孢子虫几丁质酶基因的比较基因组学分析

几丁质是构成家蚕微孢子虫细胞壁的主要成分,广泛分布于原生生物、真菌、节肢动物和甲壳类生物之中,能够被几丁质酶(EC 3.2.1.14)水解。本文基于家蚕微孢子全基因组数据,采用生物信息学方法,鉴定获得家蚕微孢子虫几丁质酶基因,命名为Nb_chi。该基因有2个拷贝,其中一个Nb_chi_1长度为2 286bp,编码761aa,pI为6.35。含有一个信号肽以及一个Glyco_hydro_19结构域。另一个拷贝Nb_chi_2仅含552bp,183aa,仅含Glyco_hydro_19结构域部分,可能为一不完整的拷贝。系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与其他种类的微孢子虫聚在同一个进化枝,均属几丁质酶第19族。本文为深入进行家蚕微孢子虫几丁质酶的功能研究奠定了基础。     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕微孢子虫分子生物学研究进展

家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原,具有食下传染和胚胎传染两种途径,对蚕业生产具有毁灭性危害。随着分子生物学技术的发展,有关家蚕微孢子虫的分子生物学研究也取得重大进展。从家蚕微孢子虫的分子生物学检测、基因序列分析、侵染相关基因等方面进行论述,为家蚕微孢子虫不同功能基因的挖掘提供科学依据,为进一步阐明家蚕微孢子虫与宿主家蚕的侵染机制提供理论基础。     

家蚕微孢子虫表面抗原蛋白对家蚕致病性的影响

家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫通过食下传染和胚种传染引起的,对蚕业生产影响很大,历来是蚕种的检疫对象,为此对家蚕微孢子虫的研究一直是一个重要课题。除Ｐａｓｔｅｕｒ(1870)提出的母蛾检验外,相继出现了双向免疫扩散法,凝集法,荧光抗体法,酶联免疫吸附法,酶标抗体法,免疫过氧化物酶染色法及单克隆抗体法等方法[1],这些方法各有特色。但基本上都是以识别检测微孢子虫的表面抗原蛋白为基础。河原勇[2]根据微孢子虫表面抗原蛋白的不同将家蚕Ｎｏｓｅｍａ属分为3种类型,即Ｂｏｍｂｙｃｉｓ型、Ｍ11型、Ｍ12型。本文以家蚕微孢子虫的表面抗…     

广西野外昆虫微孢子虫对家蚕交叉感染情况调查

为了了解广西野外昆虫微孢子虫对家蚕交叉感染情况,开展了对野外昆虫感染微孢子虫情况调查,并研究其对家蚕的感染性。调查了桑螟、桑尺蠖、菜粉蝶、斜纹夜蛾和桑毛虫等昆虫的微粒子病自然感染率,测试菜粉蝶、桑尺蠖、斜纹夜蛾微孢子虫对家蚕的病原性及可能存在的自然感染方式,观察野外昆虫微孢子虫孢子的形态差异。结果表明:菜粉蝶、桑尺蠖微孢子虫对家蚕蚁蚕的半数感染浓度(IC50)分别为2.69×105个/mL和7.42×105个/mL,斜纹夜蛾微孢子虫对家蚕也具有食下感染能力,菜粉蝶微孢子虫对家蚕也有轻微的胚种传染能力。带病野外昆虫可以通过粪便或鳞毛传播孢子虫。虽然上述野外昆虫微孢子虫的形态与家蚕微粒子孢子虫具有明显差异,但对家蚕都有较强的交叉感染性。     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系

微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。     

家蚕微孢子虫感染家蚕对其中肠和血液蛋白酶活性影响

本试验测定了不同浓度剂量微孢子虫感染家蚕后,家蚕中肠和血液中蛋白酶的变化.并对不同浓度剂量家蚕微孢子虫感染家蚕后对家蚕发育的影响和不同组织中所含微孢子虫孢子的浓度等作了初步的研究.从本实验中可以看出,感染不同浓度微孢子虫的家蚕,体内相同组织的微孢子虫数量存在显著差异.而感染相同浓度微孢子虫的蚕,不同组织中微孢子虫的数量也有差异,中肠的微孢子虫数量远高于其他部位.感染微孢子虫后,家蚕血液中的蛋白酶活性显著升高,中肠的蛋白酶的活性变化不显著,而感染微孢子虫的数量对血液和中肠中的蛋白酶的活性无显著影响.     

家蚕微孢子虫在干燥的自然环境中存放不同时间对家蚕的感染性试验

通过对家蚕添食新鲜的和存放不同时间的家蚕微孢子虫,判断其微孢子虫的活力变化情况。利用不同株系新鲜的和分别存放在室内干燥自然环境中1年、2年的家蚕母蛾体内微孢子虫对4龄家蚕进行添食试验。添食新鲜的云南株和镇江株家蚕微孢子虫对家蚕都具有很强的感染性,云南株食下感染率达99.0%,镇江株食下感染率达96.5%;添食在干燥的自然环境中存放1年后的母蛾体内家蚕微孢子虫,家蚕的食下感染率云南株为5.5%,镇江株为0;添食在干燥的自然环境中存放2年后母蛾体内家蚕微孢子虫,云南株和镇江株食下感染率均为0。结果表明,在干燥的自然环境中的家蚕微孢子虫随着时间的推移会逐渐失去活性。     

山东省病原性家蚕微孢子虫的初步研究

从山东省境内家蚕成虫体内分离到 4种病原性家蚕微孢子虫 ,与N .b比较研究结果表明 ,4种微孢子虫的大小、形态、极丝圈数及倾斜角与N .b相比均存在差异 ,但血清学反应及在蚕体内的发育过程与N .b相同。初步认为该 4种病原性微孢子虫为N .b的同属微孢子虫。这 4种微孢子虫对家蚕具有极强的食下感染率和胚种传染力。     

广东省昆虫微孢子虫资源调查及交叉感染的研究

为了探明广东省蚕区的家蚕新型微孢子虫来源 ,开展了昆虫微孢子虫资源的调查及昆虫间微孢子虫交叉感染的研究。先后从广东省蚕区家蚕体内分离到 8种新型微孢子虫 ,与家蚕传统微粒子病病原Nosemabombycis相比 ,不论是生物学特性以及对家蚕的病原性等方面均存在明显差异。对广东省不同地区捕捉的 389种昆虫进行显微镜调查 ,从 5 1种昆虫体中检到微孢子虫 ,其中 ,2 8种昆虫分离的微孢子虫可食下感染家蚕 ,18种对家蚕具胚种传染能力。调查了 9种昆虫分离的微孢子虫对 5种昆虫的病原性 ,也见明显的交叉感染现象     

家蚕微孢子虫(浙江株)α-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

基于微孢子虫分类学地位的争议,通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的α-Tubulin基因,利用BioEditor将核苷酸序列翻译成氨基酸序列,并从NCBI中收集不同物种的α-Tubulin基因,用CLUSTALX(1.81)、Mega2以及在线生物信息学软件CLUSTALW(1.83)分析序列并构建系统发育树。结果显示:家蚕微孢子虫及其它微孢子虫与真菌聚为一类,且微孢子虫以一个独立群与接合菌(zygomycetes)的噬虫霉属(Entomophaga)、耳霉属(Conidiobolus)关系最近,与子囊菌(ascomycetes)、担子菌(basidiomycetes)、壶菌(chytrids)及其它接合菌互为姐妹群。     

从野外昆虫体内分离的5株微孢子虫的生物学特性与分子系统发育研究

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的体内收集到5株对家蚕有一定食下感染力的微孢子虫,通过生物学性状、分子系统发育研究,为其分类鉴定提供依据。来自野外昆虫的5株微孢子虫均具有Nosema属的生物学特性:显微镜下观察形状均呈长卵圆形,与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)有较明显差异;在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,最后形成双核成熟孢子;与Nb抗血清均产生阳性凝聚反应;超微结构观察均具双核,极丝圈数在12～14圈之间,极丝倾斜角与Nb有差异。根据5株野外昆虫微孢子虫与其它昆虫微孢子虫基于SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及基于SSU rRNA和rRNA ITS基因序列进行的相似性和遗传距离分析,初步认为5株野外昆虫微孢子虫与家蚕微孢子虫同属异种。     

九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究

以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上