内皮素-1(ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖和黑素生成的影响

旨在研究内皮素-1 (Endothelin-1,ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞(Melanocyte,MC)增殖和黑素合成的影响.本研究中,体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,观察不同浓度ET-1(0、0.1、1、10、100 nmol·L-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖、黑素含量、内皮素受体B(Endothelin recepter B,EDNRB)基因、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因、酪氨酸相关蛋白-1(Tyrosinase related protein 1,TRP-1)基因和表皮黑皮素1受体(Melanocortin 1 receptor,MC1R)基因表达量的影响.结果表明,ET-1处理羊驼皮肤黑素细胞3d后,羊驼皮肤黑素细胞增多,黑素含量、EDNRB、TRP-1和TYR基因表达量都明显增加(P＜0.05),以10 nmol·L-1组最为显著.ET-1能诱导羊驼皮肤黑素细胞增殖、树突增长,诱导EDNRB、TYR和TRP-1基因表达量增高,使黑素合成增加；同时诱导MC1R基因表达量增高,从而通过α-MSH信号通路对羊驼黑色素的生成产生影响.     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。     

不同毛色绵羊皮肤组织中MC1R、Agouti及TYR基因差异表达研究

本研究旨在探究特定杂交模式下产生全黑被毛绵羊TYR、MC1R及Agouti基因互作调控毛色的机制。随机选取黑色和白色被毛绵羊各4只,采集皮肤组织,利用qRT-PCR技术测定MC1R、Agouti及TYR基因mRNA在不同毛色绵羊皮肤中的表达量。结果显示:MC1R、Agouti及TYR基因在不同毛色绵羊皮肤中均有表达,其中TYR基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01),MC1R基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量高于白色绵羊皮肤,但差异不显著,Agouti基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量显著低于白色绵羊皮肤(P<0.05)。综上,该杂交模式下产生的黑色绵羊可能是由于Agouti基因表达量低而使α-MSH诱导信号通路处于激活状态,上调了TYR基因表达量,导致真黑素含量上升,出现黑色毛色性状。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

在羊驼皮肤黑色素细胞中α-黑素细胞刺激素对诱导一氧化氮合酶的影响

为研究α-黑素细胞刺激素（α-Melanocytestimulatinghormone,α-MSH）对诱导型一氧化氮合酶（NOS2）在羊驼皮肤黑素细胞中的影响。采用体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,检测不同浓度α-MSH（0、10-9、10^-8、10^-7moL／L）对羊驼皮肤黑素细胞中诱导型一氧化氮合酶（NOS2）基因...     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

不同代次羊驼皮肤黑素细胞TYR基因表达变化的研究

为了探讨TYR基因在体外培养的羊驼皮肤黑素细胞不同代次间表达变化差异,根据Gen Bank中已发现的序列(EU293064)设计引物和探针,以羊驼皮肤黑素细胞的RNA为模板,采用QRT-PCR Taq Man探针法研究羊驼酪氨酸酶基因在不同代次间羊驼皮肤黑素细胞中m RNA表达量.结果表明,经过内参基因校正后,第10代羊驼黑素细胞中TYR基因的相对表达量是第3代细胞相对表达量的25倍(P0.01),第10代细胞与第5代细胞表达差异不明显(P0.05)。表明TYR基因表达量的差异与羊驼皮肤黑素细胞传代可能存在一定的相关性。     

IFN-γ对羊驼皮肤黑色素细胞增殖和黑色素合成的影响

旨在研究IFN-γ对黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响。不同浓度IFN-γ(0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0ng·mL-1)分别处理羊驼皮肤黑色素细胞24、48和72h。MTT法检测黑色素细胞活力,紫外分光光度法检测黑色素含量,qRT-PCR检测MC1R、TYR、TYRP1、MITF、DCT及NOS2mRNA水平的变化。结果显示,24h黑色素细胞活力受到抑制,72h细胞活力恢复且黑色素合成增强;IFN-γ可促进黑色素含量的增加,以32.0ng·mL-1 IFN-γ增加极显著。TYRP1、MITF、DCT、NOS2mRNA相对表达量显著增加(P0.05),MC1R、TYR mRNA相对表达量增加不显著(P0.05)。IFN-γ可促进黑色素细胞树突增长,可能有助于黑色素的转运;IFN-γ诱导黑色素的合成,可能与黑色素细胞中NOS2和MITF的高表达有关,可能通过NO/cGMP/PKG介导的信号通路合成黑色素。     

黑素皮质素受体1(MC1R)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位研究

旨在通过研究黑素皮质素受体1(MC1R)在羊驼皮肤组织中的定位与表达,探讨其在羊驼毛色形成中的作用机制及与毛色的相关性。选用成年白色羊驼与棕色羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法及免疫印迹法(Western blotting),对MC1R在羊驼皮肤中的表达进行定位和定量分析。结果,(1)免疫组化结果显示,MC1R蛋白在白色和棕色羊驼皮肤表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛乳头以及毛球周围都呈阳性着色。在棕色羊驼,阳性表达部位主要分布于毛球顶部及表皮,呈强阳性着色。在白色羊驼,阳性表达部位主要在外根鞘及表皮,毛球部表达呈弱阳性。MC1R在棕色羊驼皮肤组织中极显著表达(P<0.01)。(2)Western blotting结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在分子量约35ku与兔抗MC1R多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,且棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼,差异极显著(P<0.01)。MC1R在羊驼皮肤组织中的定位与表达量的不同与羊驼毛色表型之间存在一定的相关性。     

乌骨绵羊MC1R基因多态性研究

酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)是动物黑色素生物合成过程的重要酶,黑素皮质素1受体(MC1R)一旦与配体α-促黑素细胞激素(α-MSH)结合,对TYR、TYRP1和TYRP2酶活性的表达水平均有重要影响,因此认为MC1R是黑素合成模式的控制点。本研究以MC1R基因为候选基因,对乌骨绵羊MC1R基因多态性进行了研究,希望揭示MC1R基因与乌骨绵羊乌质性状之间的关系。结果表明,乌骨绵羊MC1R基因存在2个多态位点,分别为A12G和G144C。翻译表明这2处突变都为同义突变,对应的氨基酸分别是丝氨酸(Ser)和亮氨酸(Leu)。PCR-RFLP分析发现绵羊MC1R存在2个等位基因,即MC1R*1和MC1R*2,对应11型、22型和12型3种基因型。乌骨绵羊和兰坪本地绵羊MC1R等位基因的频率差异不显著,而与罗姆尼羊差异显著,推测MC1R基因可能不是控制乌骨绵羊乌质性状的主效基因。     

羊驼MC1R基因克隆及其在不同毛色个体中表达水平研究

为了获取羊驼MC1R基因序列,探索MC1R基因表达水平与羊驼毛色之间的相关性,根据GenBank已发表序列(EU1358800)设计1对引物,以羊驼皮肤总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增并成功获得了中华白色羊驼MC1R基因cDNA序列,长度为1 081 bp,编码317个氨基酸,与已发表序列进行对比,同源性为99%,发现7处突变.根据所克隆序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR),分析MC1R基因在白色和棕色羊驼皮肤中的基因表达量,并对结果进行统计分析.结果表明:经过内参基因校正后,棕色羊驼皮肤中MC1R基因的相对表达量是白色羊驼相对表达量的4.32倍(P<0.01).MC1R基因表达量的差异与羊驼毛色表型之间可能存在一定的相关性.     

CDK5对羊驼皮肤黑色素细胞TYR和MITF mRNA表达的调节

为了证实CDK5是否参与羊驼毛色的形成,本研究主要对CDK5在羊驼黑色素细胞中调节TYR和MI TF的表达进行了研究.本研究首先采用免疫组织化学方法检测CDK5在羊驼皮肤黑色素细胞中的定位,再通过脂质体将CDK5转染于羊驼皮肤黑色素细胞,之后通过Western blot和qRT-PCR的方法检测转染后黑色素细胞中CDK5蛋白、TYR和MITF mRNA的表达.免疫组化结果显示CDK5位于黑色素细胞的胞质和细胞核内;Western blot结果显示转染组黑色素细胞中CDK5蛋白表达量明显高于对照组;qRT-PCR结果显示CDK5可下调MITF的表达,同时上调TYR的表达,转染组黑色素细胞中MITF和TYR mRNA的表达水平分别是对照组细胞的0.264 9和3.931 3倍.结果揭示CDK5可能通过调节黑色素细胞核中TYR和MITF mRNA的表达,从而参与调控羊驼毛色形成.     

不同毛色牦牛皮肤组织学观察及MC1R基因功能验证

旨在阐明不同毛色牦牛皮肤组织形态学特点及MC1R调控黑色素合成的可能分子机制。采集大通牦牛(黑褐色)和天祝白牦牛(白色)各6头的背部皮肤组织,用甲苯胺蓝染色法分别对不同毛色牦牛皮肤组织进行染色,观察黑色素和成熟黑色素细胞的含量差异及分布特征,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MC1R在不同毛色牦牛皮肤中的表达差异。B16小鼠黑色素瘤细胞中转染shRNA MC1R干扰载体后,应用qRT-PCR和Western blot检测转染效率,分析比较各组中与毛色相关基因(Agouti、MITF、TYR)的表达差异性,利用酶标仪检测不同时间点黑色素产量。结果表明,两种毛色牦牛的表皮和毛囊周围均分布着大量的黑色素细胞,但天祝白牦牛仅在表皮基底层和毛根处检测到少量黑色素,而大通牦牛表皮层和毛囊处产生大量黑色素。与大通牦牛相比,天祝白牦牛皮肤中MC1R表达量极显著降低(P0.01)。在成功抑制MC1R的B16细胞中,TYR表达量极显著降低(P0.01),MITF表达量显著降低(P0.05),而Agouti表达量未发生显著变化(P0.05);同时黑色素含量减少。综上表明,黑色素大量沉积与MC1R高表达是导致牦牛毛色差异的原因。将shRNA MC1R载体成功转染B16小鼠黑色素瘤细胞后,MC1R的抑制情况与下游调控基因TYR表达一致,进而降低黑色素含量,说明MC1R对黑色素的合成及毛色形成起重要的调控作用。     

黑素皮质素受体1（MC1R）基因的研究进展

黑素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor,MC1R)基因,也称为促黑素细胞激素受体(MSHR)基因,是由扩散位点(extension locus,E) 编码的,是控制动物黑色素合成的重要基因。作者对MC1R基因结构功能、作用机理、基因的定位与多态性检测进行了综述。     

鹅黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是其黑素皮质素受体MCR（MC1-5R）家族成员之一,属G蛋白偶联受体。它可与瘦蛋白、神经肽、α-黑素细胞刺激素等一起调节动物体重和采食量。参考鸡MC4R基因序列设计引物,克隆并测序了鹅MC4R基因。结果表明,鹅MC4R基因编码区全长996 bp,其核苷酸序列与鸡的同源性为95.3%,与人、牛、猪等哺乳动物同源性在75%-79%;其氨基酸序列与鸡的同源性达到98.5%。构建哺乳类、鸟类和鱼类MC4R基因核苷酸进化树显示,鹅较早地与哺乳类动物分化开来。分析MC4R蛋白的氨基酸残基特性参数表明,MC4R的7次跨膜结构与MC4R的亲水性区域、电荷密度以及氨基酸残基位于表面概率的变化规律相一致。     

MC1R基因在山羊皮肤组织及B16-F10细胞中的表达分析

为了探讨黑素皮质素受体1 (melanocortin 1 receptor, MC1R)基因在不同肤色成年山羊皮肤组织中的表达及其对黑色素细胞增殖和分化的影响,试验以成年酉州乌羊、板角山羊及小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16-F10细胞)为研究材料,采用实时荧光定量PCR方法检测MC1R基因在山羊皮肤组织及B16-F10细胞增殖、分化过程中的表达情况。结果表明:MC1R基因在成年酉州乌羊皮肤组织中的相对表达量极显著高于板角山羊(P0.01);在B16-F10细胞增殖阶段,MC1R基因相对表达量先上升后下降,在24, 72, 120小时时的相对表达量显著高于6, 168小时时(P0.05);在B16-F10细胞分化阶段,MC1R基因在分化后期(72, 120, 168小时)的相对表达量显著高于前期(6, 24小时)(P0.05)。说明MC1R基因对动物皮肤黑色素生成和沉积起重要作用,且对黑色素细胞的增殖和分化有一定促进作用。