间接ELISA检测奶牛乳房炎疫苗保护效果方法的建立

本研究通过对细胞抗原制备、最佳抗原包被浓度的确定、抗原包被和封闭最佳条件确定、酶标抗体的最佳工作浓度及作用时间等反应体系的筛选和确定,建立了检测抗乳房炎疫苗抗体的间接ELISA方法.结果表明,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌抗原、停乳链球菌最佳包被浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、10μg/mL:包被条件为4℃过夜:用2%人血白蛋白作为封闭剂最佳封闭条件是37℃封闭30min;酶标抗体最佳作用时间为30min.攻毒试验表明,疫苗免疫后,血清中抗体滴度达到或超过免疫前2倍时,对奶牛乳腺即具有较好的保护效力.这一指标可作为疫苗效力检验的标准.     

奶牛乳房炎病原菌人工诱发奶山羊急性乳房炎试验

用从临床型乳房炎奶牛的乳样中分离的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌 3种菌 ,经乳室注入不同的菌数感染泌乳奶山羊分别诱导急性乳房炎试验。结果表明 ,3种菌经奶山羊乳头注入均可引起程度不等的乳房炎症状 ,出现乳腺肿胀湿热、触之硬实或有痛感 ,乳汁颜色发生变化 ,奶中氯化物及细胞数均升高 ,产奶量下降 ,并伴有体温升高 ,心率增加等全身症状。这些病理变化的严重程度与攻菌菌株的毒力及攻菌量有一定的关系 ,其中以金黄色葡萄球菌攻菌后引起的乳房炎病理变化最为明显 ,无乳链球菌次之 ,停乳链球菌较轻。通过本试验初步测得了 3种菌人工感染奶山羊引起急性乳房炎的最小攻菌量 ,金黄色葡萄球菌为1 .52× 1 0 6个菌 ,无乳链球菌为 7.7× 1 0 6个菌 ,停乳链球菌为 3 .0× 1 0 5个菌 ,同时初步建立了人工感染泌乳奶山羊的乳房炎实验动物病理模型 ,为进一步研究乳房炎菌苗、病理学、抗菌药物药动学及药效学提供了实验基础     

无乳链球菌CP+Sip-FbsA偶联蛋白免疫学特性的研究

为研究无乳链球菌荚膜多糖(CP)与表面免疫相关蛋白(Sip)和纤维蛋白原结合蛋白(FbsA)串联表达蛋白的偶联物CP+Sip-FbsA对无乳链球菌性奶牛乳房炎的免疫保护效果,本研究将纯化的CP+Sip-FbsA偶联物与铝盐佐剂混合,免疫泌乳期Wistar大鼠。通过ELISA方法进行血清效价检测和特异性抗体动态监测,以及T淋巴细胞增殖试验、流式细胞术、全血吞噬调理试验和大鼠乳腺攻毒保护试验对其免疫学特性进行研究。结果表明:与对照组相比,CP+Sip-FbsA免疫组血清中的抗体水平明显增高,T淋巴细胞增殖试验、流式细胞术、全血吞噬调理试验、大鼠乳腺攻毒保护试验显示CP+Sip-FbsA免疫组免疫效果高于其他免疫组和PBS对照组。本研究结果表明,CP+Sip-FbsA偶联物对无乳链球菌性乳房炎免疫效果较好,为进一步研究无乳链球菌亚单位疫苗提供了实验依据。     

不同佐剂乳牛乳腺炎多联灭活疫苗的免疫试验

用4种不同佐剂乳牛乳腺炎多联疫苗进行兔免疫攻毒试验。结果，蜂胶疫苗效果最好，铝胶疫苗次之。对昆明系小白鼠注射蜂胶疫苗和铝胶疫苗后第30d金黄色葡萄球菌抗体水平达到最高，无乳链球菌和停乳链球菌抗体在第21d达到峰值。在免疫健康泌乳牛的试验中，3种佐剂疫苗的免疫效果依次为蜂胶疫苗、油疫苗和铝胶疫苗；与对照组相比，免疫效果均显著(P＜0．05)。     

新剂型兔瘟疫苗的研究

经血凝抑制和攻毒试验结果表明，在含有相同抗原量制备的疫苗，兔瘟油乳剂灭活疫苗比兔瘟组织灭活苗免疫后血清ＨＩ抗体效价高３．２５￣６．０ｌｏｇ２，即使油乳剂灭活疫苗仅为组织灭活苗四分之一的抗原量，免疫后血清ＨＩ抗体效价还高１ｌｏｇ２。油乳剂灭活苗免疫兔第５０天其血清ＨＩ抗体未见下降，而组织灭活苗免疫后第２６天已开始下降。虽然接种二种剂型的疫苗攻毒后均具有１００％的保护率，但血清ＨＩ抗体效价消长情况证明     

SIP亚单位疫苗对无乳链球菌诱导小鼠乳腺炎的保护力评价

无乳链球菌是导致奶牛乳腺炎的重要病原菌,本研究评价了SIP(surface immunogenic protein)亚单位疫苗对小鼠无乳链球菌乳腺炎的免疫保护效果。制备无乳链球菌SIP亚单位疫苗和灭活疫苗,对小鼠进行免疫,并设PBS阴性对照。免疫前后采血测定IgG及IgG亚类的抗体滴度。免疫小鼠分娩后第4天,进行无乳链球菌乳腺攻毒试验。24h后扑杀攻毒鼠,进行乳腺内CFU的测定,制作并观察乳腺组织病理切片。结果显示,SIP亚单位疫苗免疫组IgG及IgG亚类抗体滴度显著高于灭活疫苗组(P0.01)。免疫哺乳小鼠乳腺攻毒后,SIP亚单位疫苗免疫组小鼠乳腺CFU显著低于灭活疫苗组及对照组(P0.001)。乳腺病理切片显示SIP亚单位疫苗组乳腺组织结构较对照组完整,且中性粒细胞浸润程度最小。本研究表明,无乳链球菌SIP亚单位疫苗有望作为奶牛无乳链球菌乳腺炎的候选亚单位疫苗。     

金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎多价疫苗的研制和免疫效果评价

为研制用于预防金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫疫苗,使用4株血清型为外膜多糖336型(336PS)、荚膜多糖5型(CP5)和荚膜多糖8型(CP8)强毒力金黄色葡萄球菌试制出金黄色葡萄球菌多价疫苗,并通过抗体水平监测、攻毒保护试验以及两个牧场的田间试验对免疫效果进行了评价。抗体水平监测显示,首免后30 d即可产生较高的抗体水平,二次免疫后有效抗体水平可持续到产后210 d;人工攻毒保护试验显示,疫苗对金黄色葡萄球菌引起的临床型乳房炎的保护率为89%;田间试验结果表明,该疫苗对奶牛临床型乳房炎的保护率在75.2%～83.3%之间,对隐性乳房炎的保护率在49.9%～52.2%之间,免疫组日产奶量较对照组平均提高1.26 kg以上。上述结果表明,所试制的疫苗可以显著降低泌乳牛金黄色葡萄球菌引起的临床型和隐性乳房炎发病率并提高产奶量。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

金黄色葡萄球菌疫苗候选抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保护作用研究

为研究金黄色葡萄球菌疫苗候选抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保护作用,分别用纯化蛋白StbA、SirH以及甲醛灭活的金黄色葡萄球菌为免疫原免疫小鼠,收集抗血清,测定血清效价,然后用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击,评价两种抗原的免疫保护作用。分别用SirH和StbA抗血清免疫小鼠,4 h后用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击,评价抗血清的保护作用。结果显示,StbA和SirH抗血清效价均为1:1 638 400。金黄色葡萄球菌攻击主动免疫小鼠,SirH纯化蛋白免疫组(60%)和StbA纯化蛋白免疫组(70%)存活率均明显高于对照组(0%)(P0.05),金黄色葡萄球菌全菌免疫组(20%)存活率与对照组(0%)差异不具备显著统计学意义(P0.05)。SirH纯化蛋白免疫组(60%)和StbA纯化蛋白免疫组(70%)存活率均高于金黄色葡萄球菌全菌免疫组(20%)。将抗血清免疫小鼠后,用金黄色葡萄球菌腹腔内注射攻击小鼠,免疫组小鼠16~18 h内全部死亡,而对照组小鼠在攻毒后12~14 h内全部死亡。结果表明,SirH和StbA是具有潜力的保护性抗原,但其抗血清都不具有保护作用。     

应用琼脂扩散法检测禽霍乱蜂胶苗免疫效果试验

应用禽霍乱琼脂扩散抗原对禽霍乱免疫鸡进行抗体检测,攻毒试验表明:血清抗体效价在1∶8倍以上时,免疫鸡可获得坚强保护力。因抗体效价与攻毒保护呈正相关,所以在不具备攻毒条件时,可应用该方法检测鸡群的抗体水平和疫苗的免疫效果。     

间接ELISA检测奶牛乳房炎多联苗抗体方法的研究

利用超声波破碎法制备无乳链球菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌可溶性抗原。对3种破碎抗原最佳包被浓度及包被条件、血清样品工作浓度、封闭液、酶标二抗的最佳工作浓度及作用时间等反应体系进行筛选和优化，初步建立了间接ELISA法检测奶牛乳房炎多联苗3种菌血清抗体的方法。对24头泌乳牛进行抗体检测，结果表明该3种抗原反应体系一致，3种抗原最适包被浓度为4—6μg／mL．血清样品最佳稀释度为1：200，该方法具有快速、简单、特异性和重复性好等优点。     

抗奶牛乳腺炎多价卵黄抗体的制备及含量测定

本研究的目的是制备抗奶牛乳腺炎主要致病菌的多价卵黄抗体并检测特异性抗体的含量。采用金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌混合抗原免疫产蛋母鸡。通过水稀释法分离卵黄抗体。采用ELISA法检测抗体效价和特异性抗体含量。多价抗体与大肠杆菌的结合效价最高可达25600,与金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的结合效价为12800。每毫升卵黄液中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌特异性卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin,IgY）的最高含量分别为2.13、2.01和1.92 mg。免疫后特异性抗体含量随时间变化趋势与抗体效价变化趋势一致。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株的筛选及灭活油乳剂疫苗的研制

血清2型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)分离株经雏鸭体内复壮、回收、鉴定后,选取其中2株细菌NJ3和Yb2进行毒力测定,结果表明其半数致死量分别为5.62×107CFU和1.07×105CFU。选取5株细菌制备灭活油乳剂疫苗后免疫鸭,并进行攻毒保护试验。结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性ELISA抗体和攻毒保护力,但是攻毒保护性差异较大,NJ3免疫后的攻毒保护性最好。抗体检测及攻毒保护实验表明NJ-3是较理想的制苗用菌株。     

鸡新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验与血清学(HI)试验的平行关系研究

对19批鸡新城疫(ND)灭活疫苗进行了效力检验,在测定PD50的同时,进行了HI抗体效价的测定,以寻找血清学与抗攻毒保护的平行关系.结果表明,免疫剂量与GMHI抗体效价和攻毒保护率呈正相关:免疫1/12.5剂量组共保护54/60(90%),GMHI抗体效价为5.6 log2;免疫1/25剂量组共保护152/191(79.6%),GMHI抗体效价为4.9 log2;免疫1/50剂量组共保护123/183(67.2%),GMHI抗体效价为4.0 log2;免疫1/100剂量组共保护46/139(33%),GMHI抗体效价为3.0 log2;对照组保护0/89(0),GMHI抗体效价≤2.0 log2.采用PD50测定的18批疫苗中,有15批合格,3批不合格;按照我国现有质量标准,即免疫1/25剂量攻毒的方法进行检验,19批疫苗中有16批合格,3批不合格;血清学方法检验19批疫苗中有17批合格,2批不合格.其中免疫攻毒效检方法与PD50测定方法的不合格疫苗批次完全相同,其中2批为免疫胚制造的疫苗,1批为进口的灭活疫苗,血清学检验不合格的2批疫苗包含在其中,三种检验方法结果基本一致.试验还发现,HI抗体效价和抗攻毒保护呈正相关:未免疫对照组鸡血清HI抗体效价≤2.0 log2,攻毒保护率为0(0/89);免疫ND灭活疫苗后如果血清HI抗体效价＜3.0 log2,攻毒保护率为3.5%(4/113);HI为3.0 log2,攻毒保护率为16.1%(14/87);HI为4.0 log2,攻毒保护率为86.7%(86/99);HI达到5.0 log2,攻毒保护率为97.2%(103/106),HI≥6.0 log2,攻毒保护率为100%(168/168).     

猪链球菌病氢氧化铝二价灭活苗免疫兔血清抗体消长规律

应用琼扩法 ( AGP)、间接 ELISA法检测猪链球菌病氢氧化铝二价灭活疫苗免疫兔的抗体水平。结果表明 ,免疫后 4d开始产生抗体 ,7d时免疫兔 1 0 0 %抗体阳转 ,1 5～30 d抗体效价达高峰。免疫后 35d血清抗体有所下降 ,二免后 5d抗体效价均显著升高 ,6个月后血清抗体在 1 :1 6 0 0。通过免疫抗体与攻毒保护相关性测试 ,抗体效价在 1 :80 0(含 1 :80 0 )以上能抵抗 1× 1 0 2 ～ 1× 1 0 3CFU马腺疫链球菌兽疫亚种强毒攻击。     

ZE515对CP5型金黄色葡萄球菌疫苗的佐剂作用

前期研究表明一种含人参皂甙的植物油佐剂ZE515对口蹄疫疫苗具有佐剂作用,本研究探讨该佐剂对荚膜多糖CP5型金黄色葡萄球菌(S.aureus)疫苗的佐剂作用。将ZE515和灭活的金黄色葡萄球菌抗原乳化制备成疫苗,ICR小鼠皮下注射疫苗免疫2次,二免后3周采血制备血清,检测血清抗体及其亚类、细胞因子IL-5和IFN-γ,取脾脏检测淋巴细胞增殖指数(SI),并对免疫鼠腹腔注射S.aureus活菌进行攻毒保护性试验。结果显示,ZE515能显著增强抗体及其亚类的免疫应答(P0.05),提高淋巴细胞增殖指数(P0.05),提升血清IL-5和IFN-γ表达水平(P0.05)。ZE515对S.aureus疫苗的佐剂作用显著强于常规铝胶佐剂,含ZE515的疫苗对S.aureus强毒攻毒的保护率为75%,而含铝胶佐剂的疫苗保护率只有50%,表明ZE515对S.aureus疫苗具佐剂作用,值得进一步研究。     

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征对塞内卡病毒灭活苗免疫效果的影响

为探究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对塞内卡病毒(SVA)灭活疫苗免疫效果的影响,对PRRS阳性猪和PRRS阴性猪分别免疫相同批次、相同剂量的SVA灭活苗,检测首次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d血清中和抗体效价,并在免疫后28 d对所有试验猪进行攻毒保护试验。结果显示,所有PRRS阳性猪的SVA血清中和抗体效价均小于1∶4,而PRRS阴性猪SVA血清中和抗体效价在二免后上升到较高水平。攻毒保护结果与中和抗体效价结果呈正相关,PRRS阳性组0/5保护,而PRRS阴性组试验猪达到5/5保护。这一研究表明PRRS会使SVA灭活疫苗免疫效果下降,为SVA及PRRS疫苗的研发及猪场疾病的防控提供了参考。     

关中奶山羊乳房炎灭活菌苗的制备及其免疫效果测定

对自制乳房炎疫苗免疫后的抗体效价进行评估.用甲醛37℃过夜灭活大肠埃希菌、葡萄球菌,分别制备蜂胶灭活疫苗、转移因子灭活苗及无佐剂疫苗,接种泌乳期奶山羊后,分别在不同时间采集免疫羊的血清和乳汁,ELISA测定血清大肠埃希菌和葡萄球菌的抗体效价.研究结果显示,大肠埃希菌和葡萄球菌经甲醛灭活彻底;与免疫前相比,血清和乳汁中的...     

奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC重组蛋白的免疫保护性研究

为研究奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC蛋白的免疫保护性,本研究采用纯化后的GapC重组蛋白与免疫佐剂乳化后制备疫苗,免疫家兔后采用间接ELISA法检测抗体效价,并以小鼠为实验动物进行攻毒试验.结果显示,抗体效价高达1:128 000,GapC蛋白免疫组对乳房链球菌的保护率较高,达70％,而全菌体免疫组的保护率仅为30％,表明GapC蛋白具有很高的免疫原性,为奶牛乳房炎的预防控制和进一步研究有效疫苗提供实验依据.