IGF2基因表达调控及其遗传变异在动物生长发育中的研究进展

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)作为胰岛素类激素家族中重要成员之一,广泛参与机体众多生理代谢过程,在癌症发生、神经调节、糖代谢疾病、骨质疏松、肌肉发育和脂肪沉积等方面具有重要的作用,其功能行使主要通过与受体IGF1R和IGF2R结合或与胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBPs和IGF2BPs竞争性结合发挥功能。鉴于IGF2基因在肌肉发育和脂肪沉积中的重要作用,发掘IGF2基因相关分子标记并解析其内在调控机理,在畜牧生产中具有重要的意义。研究发现,众多IGF2基因遗传变异与动物的生长发育之间存在显著相关关系,其可能通过影响IGF2基因印记、甲基化状态、转录因子结合或miRNA靶向结合型转录后调控等方式发挥作用。因此,文章综述了IGF2基因表达调控模式,包括IGF2与其受体的调控关系,基因印记与miRNA参与的表观遗传调控,转录因子对其的调节作用,遗传变异等方面的内容,以期为IGF2基因在动物生长发育调控相关研究中提供相应的借鉴,为分子育种提供有效线索。     

昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

金茅黑鸡miR-206表达及靶基因预测分析

为了研究miR-206的组织表达分布及其在鸡骨骼肌生长发育中的表达规律，预测其可能的作用机制，本研究采集4周龄金茅黑鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、腿肌和腹脂8种组织及2、6、10、14、16周龄胸肌和腿肌组织，利用实时荧光定量PCR技术检测miR-206在8种组织及不同周龄胸肌和腿肌中的表达，利用生物信息学方法预测其靶基因并进行功能注释。结果显示，miR-206在公、母鸡胸肌和腿肌中表达量均极显著高于其他组织（P < 0.01），在腹脂、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中低表达，为鸡骨骼肌特异性表达miRNA；miR-206均在公、母鸡腿肌和胸肌组织生长早期（2周龄）表达最高，之后表达量逐渐下降。靶基因预测和功能分析发现，miR-206共有356个靶基因，其中21个与肌肉生成相关，多个靶基因已知参与调控肌肉生成，包括配对框7（paired box 7，Pax7）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、脑衍生神经营养因子1（brain-derived neurotrophic factor 1，BDNF1）、视黄酸受体（retinoic acid receptor beta，RARB）和卷曲类受体7（frizzled class receptor 7，FZD7）基因。此外，发现miR-206靶基因富集到多条已知参与调控骨骼肌生成的信号通路，包括MAPK、Wnt、肌动蛋白骨架调控和黏着斑激酶信号通路。结合表达数据推测，miR-206可能通过靶向调控Pax7、IGF1、BDNF1、RARB、FZD7基因和MAPK、Wnt等信号通路参与调控鸡肌肉生成。本研究揭示了金茅黑鸡miR-206的组织表达分布及其在鸡骨骼肌生长过程中的表达规律，并预测了其调控骨骼肌生成的可能作用机理，为进一步研究miR-206在鸡肌肉生长发育中的作用机理和表达调控奠定了基础。     

藏鸡与白羽肉鸡垂体转录组差异表达研究

试验旨在通过对藏鸡和白羽肉鸡垂体转录组测序和生物信息学分析,筛选出与鸡生长发育相关的差异表达基因（differentially expression genes,DEGs）及信号通路。本研究选用42日龄健康藏鸡和白羽肉鸡各3只,分别采集垂体组织利用Illumina HiSeq 2000平台进行转录组mRNA测序,对筛选到的DEGs筛选DEGs,GO和KEGG数据库功能注释和富集分析,实时荧光定量PCR验证随机挑选的DEGs表达水平。结果显示,藏鸡和白羽肉鸡分别获得126 094 302和125 666 442条clean reads。与白羽肉鸡相比,藏鸡垂体组织中共有DEGs 392个,其中196个为上调基因,196个为下调基因（P<0.05）,其中包括生长激素（GH）基因、生长激素释放激素受体（GHRHR）基因和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）基因。GO和KEGG富集分析发现,DEGs显著富集于细胞黏附分子信号通路和神经活性配体-受体相互作用信号通路等细胞通讯相关的信号通路,GH、GHRHR和IGF2BP1基因也显著富集于神经活性配体-受体相互作用信号通路。实时荧光定量PCR结果显示,转录组测序结果准确可靠。综上研究,本研究初步揭示了影响藏鸡和白羽肉鸡生长发育速度差异的关键候选基因和信号通路,为了解鸡垂体组织调节生长发育的分子机制提供了理论依据。     

胰岛素样生长因子1对雌性动物生殖系统的影响

胰岛素样生长因子(IGF)包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)及其受体(IGF-2R)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)及胰岛素样生长因子蛋白酶。胰岛素样生长因子是一种单链多肽,其结构与前胰岛素相似。胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子     

胰岛素样生长因子2研究进展

胰岛素样生长因子2（IGF2）是迄今所知功能最复杂的生长调控因子,它能促进细胞的有丝分裂和分化,参与生后基因组重建,与X染色体的失活有重要关系。所有的这些功能说明IGF2在机体生长发育过程中的重要性。此外,IGF2与个体生长速度、瘦肉率、背膘厚等生产性能关系密切,在某些物种已经被作为候选基因确定下来。作为重要的印记基因,IGF2的表达状况与肿瘤,以及潜在肿瘤的发生发展关系密切,在肿瘤治疗方面起重要作用。文章综述了IGF2的基因结构、生物学作用、基因印记、生长发育和肿瘤的关系等方面的研究进展。     

IGF2BP2介导的m6A修饰调控动物脂肪沉积的研究进展

随着人们生活水平的提高，近年来优质农业动物肉产品深受我国消费者市场青睐，而脂肪沉积是影响肉品质的重要因素。因此，阐明脂肪沉积的规律对探究动物优质肉品质形成的分子机理具有重要意义。N⁶-甲基腺苷修饰(m⁶A)是真核生物中含量最丰富的一种RNA表观遗传修饰，其与RNA运输、表达及降解等多种生物学事件密切相关。研究表明人胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(IGF2BP2)介导的m⁶A修饰在动物脂肪沉积过程中发挥着关键作用，因此本文将论述m⁶A、IGF2BP2及其调控动物脂肪沉积的作用及分子机制研究进展，以期未来为家畜肉品质改良提供候选基因和科学依据。     

波兰和德国联合研究胰岛素样生长因子2受体基因SNP、STR多态性与荷斯坦黑白花奶牛泌乳性状的关系

正具有生物学活性的胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor receptor 2,IGF2R)被认为是动物产奶或产肉的遗传标记物,其利用度受IGF2R受体的调控。近期,波兰与德国的研究人员以来自波兰科学院遗传学与动物育种研究所农场的283头荷斯坦黑白花奶牛为研究对象,研究IGF2R受体基因多态性与奶牛泌乳性状的关系。鉴定出2种新型牛IGF2R基因的遗传多态性,即内含子23中多态TG重复     

IGF1R和IGF2R基因在鸭脂肪组织中的发育表达模式比较

为比较胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)和胰岛素样生长因子2受体(IGF2R)在鸭脂肪组织发育中的作用,利用RT-PCR技术,扩增出鸭IGF1R、IGF2R部分编码区序列,并采用荧光定量PCR检测IGF1R、IGF2R基因mRNA丰度在1～8周龄鸭腹脂、背皮和肝脏中的表达变化。成功获得了鸭IGF1R和IGF2R部分序列,长度分别为798 bp和716bp。腹脂中IGF1R和IGF2R基因的表达都呈先上升后下降的变化规律,4周龄时表达量最高;皮下脂肪中IGF1RmRNA的表达规律是在1周龄时极显著高于其他各时间点(P<0.01),2周龄时显著下降,随后缓慢上升到4周龄时达到最高,之后又逐渐下降。IGF2R mRNA的表达水平呈先上升后波动下降的趋势,以4周龄时表达量为最高,5～8周龄时波动下降;肝脏中IGF1R和IGF2R基因的表达规律相似,表达量总体都呈现1周龄后急剧下降而后平稳的趋势。综合上述结果可知,IGF1R和IGF2R基因对肝脏的脂肪合成以及肝外脂肪组织增殖、分化的调控具有差异性。     

ZBED6基因对巴马香猪脾发育的作用机制分析

ZBED6基因作为一个转录因子,能够与IGF2结合进而调节肌肉的生长发育。但其在脾生长发育中的作用尚不清楚,本研究利用RNA-seq测序技术比较ZBED6基因敲除巴马香猪（ZBED6-KO）和同日龄野生型巴马香猪（WT）的脾组织转录组,探究ZBED6基因对巴马香猪脾组织的发育影响。利用t检验对ZBED6-KO猪和WT猪脾组织大小的表型差异及ZBED6直接调控的靶基因IGF2的表达量进行显著性分析。提取ZBED6-KO猪和WT猪脾组织的总RNA,在Illumina Hiseq 2500平台进行RNA-seq分析。以猪Sus scrofa11.1为参考基因组,用转录组分析的标准流程筛选ZBED6-KO猪和WT猪脾组织中的差异表达基因。用DAVID在线网站对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。然后,随机选取7个差异表达的基因,利用实时荧光定量PCR技术验证测序结果的准确性与可靠性。结果显示,与WT猪相比,ZBED6-KO猪脾的重量和IGF2基因表达量均显著增加（P<0.05）,表明ZBED6基因的敲除对巴马香猪脾组织的生长发育有一定的促进作用。测序结果显示,各样本至少获得4G的数据量,每个样本的Clean Ratio及Q30比率均在90%以上,83.94%以上的reads可比对在猪的参考基因组上,表明测序数据质量良好,真实可靠;对测序数据进行转录组分析,共筛选到161个差异表达基因,其中上调基因90个,下调基因71个;差异表达基因的层次聚类分析显示,ZBED6-KO猪的3个个体（spleen1、spleen3、spleen6）的表达模式相似,WT的3个个体（spleen2、spleen4、spleen5）的表达模式相似,进一步证明测序数据的准确可靠;GO和KEGG富集分析中,富集到10条显著的GO条目以及5条显著的信号通路,2条与肌肉发育相关的通路;实时荧光定量PCR试验随机检测7个差异表达基因的表达模式与RNA-seq分析结果相一致,证实了测序数据的可靠性。以巴马香猪为模型,利用RNA-seq技术研究ZBED6基因的敲除对中国地方猪脾发育的作用影响,为挖掘ZBED6基因的更多功能提供了基础。     

鸡胰岛素样生长因子2基因(IGF2)外显子区功能性SNP预测与分析

旨在采用生物信息学方法筛选鸡IGF2基因中具有潜在生物学功能的非同义单核苷酸多态性（non-synonymous single nucleotide polymorphisms，nsSNPs）位点，为开展标记辅助选择改良鸡重要经济性状提供理论参考。本研究从dbSNP数据库中检索出鸡IGF2基因的12个nsSNPs位点，利用生物信息学软件SIFT、Polyphen-2、PhD-SNP和SNAP预测其中可能的功能性SNP；使用I-Mutant3.0和Mupro方法对突变位点的氨基酸稳定性进行分析；对鸡IGF2基因编码的氨基酸序列进行多序列比对和进化位点保守性预测，并结合MutPred2预测突变可能造成的功能后果；最后使用Sopma预测IGF2野生型和突变型的蛋白质二级结构，运用I-TASSER构建它们的蛋白质三级结构。结果发现，rs740391349（E29G）、rs735633122（T30P）、rs739078786（L31P）、rs736255842（E35G）及rs736800980（V37G）这5个nsSNPs可能影响鸡IGF2的蛋白功能，且所有位点突变都会使IGF2蛋白稳定性降低。多序列比对及保守性分析显示，rs740391349（E29G）、rs735633122（T30P）和rs736255842（E35G）为高度保守并暴露的功能性残基，MutPred2与二级结构分析结果表明，rs735633122（T30P）和rs736255842（E35G）这两个位点上的突变都导致了α螺旋百分比下降。三级结构分析表明，rs735633122（T30P）和rs736255842（E35G）这2个nsSNPs均会导致IGF2的蛋白空间结构发生变化。综上所述，T30P和E35G位点突变严重影响鸡IGF2蛋白质的结构，可能是影响鸡生长和体组成性状的重要功能性SNPs。     

昆明犬IGF-1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在系统研究昆明犬胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）基因的结构和功能，揭示该基因的组织表达规律，为探讨工作犬体型及生长发育性状提供基本数据。以昆明犬为试验材料，运用分子克隆技术扩增IGF-1基因CDS区，应用生物信息学方法进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；同时利用实时荧光定量方法检测该基因在昆明犬各组织的表达情况。结果显示，昆明犬IGF-1基因CDS区长462 bp，编码153个氨基酸，其核苷酸序列与家犬的同源性较高（100%），与小鼠和鸡的同源性较低（82.6%和81.2%）。IGF-1蛋白分子质量和理论等电点分别为16.97 ku和9.36，属亲水性分泌型蛋白，无跨膜结构，存在信号肽区域（第1-48位氨基酸）；亚细胞定位分析表明，IGF-1蛋白主要分布于细胞核（56.5%）及线粒体（17.4%）中；磷酸化位点分析发现，IGF-1蛋白存在15个磷酸化位点；该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。组织表达显示，IGF-1基因在昆明犬不同组织中均有表达，尤其在脾脏、肝脏及肾脏中呈现高表达。本试验结果为今后深入研究IGF-1基因功能提供了理论参考，并为深入探讨IGF-1基因对昆明犬生长发育性状研究提供一定的基础资料。     

Prediction and Analysis of Functional SNP on Exon Region of Insulin-like Growth Factor 2 Gene (IGF2) in Chickens

The aim of this study was to use bioinformatics methods to screen non-synonymous single nucleotide polymorphisms (nsSNPs) sites with potential biological functions in chicken IGF2 gene and provide a theoretical basis for carrying out marker-assisted selection to improve important economic traits of chicken. Twelve nsSNPs sites of chicken IGF2 gene were retrieved from dbSNP database. SIFT, Polyphen-2, PhD-SNP, and SNAP were used to predict the possible functional SNPs. The amino acid stability of mutation sites was analyzed by I-Mutant3.0 and Mupro methods. Multiple sequence alignment and conserved prediction of evolutionary sites were carried out on the amino acid sequence encoded by chicken IGF2 gene, and combined with MutPred2 to predict the possible functional consequences caused by mutations. Finally, Sopma was used to predict the secondary structure of IGF2 wild-type and mutant proteins, and I-TASSER was used to construct their tertiary structure. The results showed that rs740391349 (E29G), rs735633122 (T30P), rs739078786 (L31P), rs736255842 (E35G) and rs736800980 (V37G) might affect the protein function of chicken IGF2, and all the mutations reduced the protein stability of IGF2. Multiple sequence alignment and conservative analysis showed that rs740391349 (E29G), rs735633122 (T30P), and rs736255842 (E35G) were highly conserved and exposed functional residues. MutPred2 and secondary structural analysis showed that mutations at rs735633122 (T30P) and rs736255842 (E35G) both led to a decreased percentage of α-helix. Tertiary structural analysis showed that rs735633122 (T30P) and rs736255842 (E35G) could change the spatial structure of IGF2 protein. In summary, mutations at T30P and E35G seriously affect the structure of chicken IGF2 protein and may be the significant functional SNPs affecting chicken growth and body composition traits.     

利用简化基因组测序筛选安格斯牛生长相关的受选择基因

旨在探究安格斯牛生长相关的受选择基因,为肉牛生长相关主效基因的鉴定提供参考。本试验共采集72头南阳牛母牛和14头黑安格斯牛母牛血样并提取基因组DNA。利用SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技术获得全基因组SNP标记并对试验个体基因型进行分型。通过计算各SNP位点的遗传分化系数（Fst值）和核苷酸多态性（π ratio）筛选两品种间的差异基因组区域,并与动物QTL数据库中牛生长性状QTLs进行比对,重合区域作为候选区域。随后对候选区域内基因进行功能注释以筛选候选基因,并根据"Expression Atlas"数据库对候选基因的组织表达情况进行分析。经筛选后,本试验共得到69 762个SNPs,以Fst值和π ratio值的99%分位数为阈值筛选得到33个两品种间高度差异的基因组区域,其中16个基因组区域与生长性状相关QTLs重合。这些区域共包含27个基因,其中4个基因（FXR1、ADAR、IGF1和MNF1）与骨生长、肌肉发育和生长调控有关。FXR1和MNF1均在骨骼肌组织中高表达,ADAR和IGF1分别在脑组织和肝脏中表达最高。结果提示,IGF1基因可作为影响肉牛生长的关键候选基因,FXR1、ADAR、MNF1基因可优先进行进一步验证研究。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

Efficient Site-directed Mutation of Porcine IGF2 Gene via Base Editors

This study was aimed to efficiently and accurately edit the growth trait-related gene insulin-like growth factor 2 (IGF2) in porcine fetal fibroblasts cells (PFFs) of Bama pigs using base editors.The IGF2 gene sequences of Bama pigs and Large White pigs were identified by PCR amplification and sequencing,and the expression vector of sgRNA-IGF2 targeting Bama pigs was constructed.Then the editing efficiency and product types at IGF2 gene via different base editors were studied by cell transfection,detection of mixed cell editing efficiency,screening of single cell colonies and genotyping.The results showed that there was a single nucleotide polymorphism (SNP) site at 3 072 bp in intron 3 of IGF2 gene between Bama pigs and Large White pigs,and a single-stranded oligonucleotide sequence targeting the IGF2 gene was designed.The single-stranded oligonucleotide was annealed and ligated with the BsaⅠ-linearized pGL3-U6-sgRNA plasmid to construct the sgRNA-IGF2 expression plasmid.The sequencing results of the recombinant plasmid showed that the sgRNA sequence was accurately inserted between the U6 promoter and the sgRNA scaffold.Four different cytosine base editors (rA1-BE3,hA3A-BE3,hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F) were co-transfected with sgRNA-IGF2-expressing plasmid into PFFs,respectively.The editing efficiency in mixed cells showed hA3A-BE3-based CBEs could introduce higher efficiency of C-to-T mutation than rA1-BE3 (P<0.05).The results of flow cytometry,single cell culture and genotyping showed that 71.43% of single cell colonies were mutant in hA3A-BE3 group,but 42.86% of them had insertions/deletions (indels).The editing efficiency of hA3A-BE3-Y130F (56.86%) and hA3A-eBE-Y130F (40.38%) were lower than hA3A-BE3(71.43%),but the indels of them were also lower (31.37% and 21.15%).In addition,single cell colonies with homozygous mutation at IGF2 gene site were achieved by base editors in this study.Base editors,as new gene editing tools,could efficiently and accurately modify SNP associated with economic traits in pig genome and accelerate genetic improvement.