牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术研究(中)

为制定埃普利诺菌素(EPR)休药期及建立牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术提供科学依据。采用荧光高效液相色谱法(HPLC-FLD)检测埃普利诺菌素(EPR)注射剂在牦牛奶中的残留消除规律。结果表明:给泌乳牦牛皮下注射EPR注射液0.2mg·kg^-1剂量,EPR在牛奶中分布浓度较低,在给药后54.00h,牛奶中的EPR浓度达到峰值7.38±2.61ng·mL^-1,该值低于美国规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(12ng·mL^-1)和欧盟及联合国粮食与农业组织(FAO)规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(20ng·mL^-1)。给泌乳牦牛皮下注射EPR注射液0.4mg·kg^-1剂量,EPR在牛奶中分布浓度较低,在给药后42.00 h,牛奶中的EPR浓度达到峰值8.42±4.62 ng·mL^-1,最高值低于欧盟和联合国粮食与农业组织(FAO)规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(20 ng·mL^-1),略高于美国规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(12ng·mL^-1);在给药后56.00 h,牛奶中的EPR浓度达到峰值6.98±2.98 ng·mL^-1,该值低于美国规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(12ng·mL^-1)和欧盟及联合国粮食与农业组织(FAO)规定的EPR在牛奶中的最高残留限量(20ng·mL^-1)。国产药物试验组与进口商品化制剂对照组的两种EPR浇泼剂在牦牛血浆中的残留消除规律,分别于1.67±0.2d与1.83±0.61d(Tmax)在血浆中达到最高药物浓度(Cmax)7.88±2.68ng·mL^-1与5.94±2.80ng·mL^-1,两种EPR制剂的生物等效性无显著性差异。国产和进口两种制剂的残留均低于联合国粮食与农业组织(FAO)所规定的最高残留限量(20ng·mL^-1)。研究结果表明,EPR注射剂0.2mg·kg^-1、0.4mg·kg^-1,EPR浇泼剂0.5mg·kg^-1推荐剂量用于泌乳牦牛无需弃奶期,牦牛乳用时无需休药期或建议休药期为1d。为建立牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术提供了依据。     

埃普利诺菌素浇泼剂对牦牛皮蝇幼虫驱除效果试验

应用埃普利诺菌素浇泼剂驱除牦牛皮蝇幼虫,并设埃普利诺菌素注射剂药物对照组和阳性对照组。结果：剖检埃普利诺菌素浇泼剂300μg/kg,400μg/kg,500μg/kg剂量组牦牛与药物对照埃普利诺菌素注射剂组及伊维菌素浇泼剂组牦牛,均未检出皮蝇1期幼虫,而阳性对照组牦牛皮蝇1期幼虫感染率35.0%,平均感染强度29.4（9～53）条。翌年3、5月份两次触摸检查牛背部皮下瘤疤和皮肤虫孔,4个药物试验组牦牛均未检出,而阳性对照组牦牛两次检查平均感染率45.16%,平均感染强度6.45个。试验证明埃普利诺菌素浇泼剂低、中、高3个剂量对寄生于牦牛的皮蝇幼虫驱净率、驱虫率均达100.0%,高效安全。     

牦牛皮蝇蛆病低残留防治技术研究

应用埃普利诺菌素注射剂采用常规与微量给药技术,进行对牦牛皮蝇蛆病的防治试验,10月下旬给药,翌年3、5月份两次触摸检查牛背部皮下瘤疱和皮肤虫孔,并设阳性对照组,评价两种给药技术对牦牛皮蝇蛆病的防治效果。结果:两次检查阳性对照组平均感染率为39.15%,平均感染强度6.75(1~17)个;埃普利诺菌素注射剂常规剂量100、200、300μg/kg试验组牦牛两次检查平均治愈率和驱虫率均达100.0%;埃普利诺菌素注射剂微量10、20、30μg/kg防治组平均治愈率分别为86.3%、94.2%和100.0%,驱虫率分别为79.7%、93.2和100.0%。使用安全。给泌乳牦牛皮下注射埃普利诺菌素注射液0.2mg/kg后54.00h,牛奶中的埃普利诺菌素浓度达到峰值7.38±2.61ng/m L,低于美国(12 ng/m L)和欧盟(20ng/m L)规定的埃普利诺菌素在牛奶中的最高残留限量标准,不需休药期;皮下注射0.4mg/kg后56.00±26.31h,牛奶中的皮下注射浓度达到峰值6.98±2.98ng/m L,低于欧盟规定(20ng/m L),不需休药期,高于美国规定(12ng/m L),需休药期。适合当前家畜健康养殖中对牦牛寄生虫病防治的需要。     

牛皮下注射爱普菌素的组织药代动力学试验

牛皮下单次注射爱普菌素注射剂,剂量为0.5 mg/kg,给药后在不同时间点采取肌肉、肝脏、肾脏和脂肪等组织样品检测爱普菌素残留,采用3P97软件对组织残留-停药时间数据进行分析.结果表明,注射部位、肝脏中爱普菌素残留浓度变化符合二室开放模型,肌肉、肾脏、脂肪中EPR残留浓度变化符合一室开放模型.爱普菌素经皮下注射后Tmax均小于1 d(0.17～0.76 d),Cmax范围在37.32～1453.79 ng/g之间.MRT范围在7.54～14.79 d之间,与T1/2el范围2.91～19.50 d相一致,说明药物在动物体内消除缓慢.     

牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术研究(上)

本研究评价了埃普利诺菌素注射剂、浇泼剂对牦牛主要寄生虫病的驱虫疗效,为建立牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术提供依据。选用自然感染线虫、牛颚虱和皮蝇蛆的牦牛,采用粪检法和剖检法进行驱虫疗效试验。结果:埃普利诺菌素注射剂0. 1,0. 2,0. 3mg/kg剂量组消化道线虫虫卵转阴率分别为85. 0%,95. 0%和100. 0%,减少率分别为91. 9%,98. 4%和100. 0%。0. 2,0. 3mg/kg剂量组对牦牛网尾线虫L1转阴率和减少率均达100. 0%。0. 1mg/kg剂量组L1转阴率和减少率分别为90. 0%和95. 2%。0. 2,0. 3mg/kg剂量组原圆线虫L1转阴率分别为93. 3%,100. 0%,减少率分别为98. 3%,100. 0%。0. 1mg/kg剂量组L1转阴率和减少率分别为80. 0%,88. 5%。3个试验组对线虫成虫的总计驱虫率分别为90. 5%,97. 2%和99. 5%。埃普利诺菌素注射剂0. 3mg/kg剂量组给药后3d牛颚虱大部分死亡干瘪,第7d全部死亡干瘪,驱虫率均达100. 0%。0. 1mg/kg剂量组低剂量组的杀虫效果次于上述剂量。0. 2mg/kg剂量组与IVM注射剂0. 2mg/kg体重剂量组驱虫效果无显著差异。3个剂量组对牦牛皮蝇蛆的驱净率、驱虫率均达100. 0%;埃普利诺菌素浇泼剂0. 4mg/kg剂量组对牦牛消化道线虫的虫卵转阴率、减少率分别为95. 0%和96. 4%～98. 3%。对牛颚虱和皮蝇蛆的驱杀效率均为100%。0. 5mg/kg剂量组对牦牛消化道线虫的虫卵转阴率、减少率均达100. 0%,对牛颚虱和皮蝇蛆的杀虫效果均达100%,对牛颚虱与牦牛体内消化道线虫持效期至少为28d。研究结果表明,埃普利诺菌素注射剂、浇泼剂对牦牛线虫病、牛颚虱与牛皮蝇蛆病等主要寄生虫病的驱虫疗效高,有很好的控制效果。     

埃谱利诺菌素注射剂对绵羊体内外寄生虫的驱杀效果试验

埃普利诺菌素(eprinomectin,EPR)是一种新型的阿维菌素类药物,EPR的抗虫活力及抗虫谱与其他阿维菌素类药物相似,对家畜的绝大多数线虫和螨、虱、蜱、蝇等节肢动物均有很强的杀灭作用,其显著之处为用于奶牛和肉牛时无需休药期。     

爱普利注射液对牛线虫病的疗效试验

目前，线虫的防治手段有：生物学防治、饲养管理、化学防治以及免疫学防治和抗虫品种的培育等。但化学防治一直处于主导地位。化学药物主要有有机磷类、苯丙咪唑类、酚塞嗪类、阿维菌素类等。阿维菌素类药物是目前使用最广的寄生虫药物，具有很强的杀灭胃肠道线虫、肺线虫和心血管丝虫作用。阿维菌素类药物中爱比菌素（ABA）、多拉菌素（DOR）和伊维菌素（IVM）在动物组织中残留时间较长，应用于牛时需要28天的休药期．这给用药带来了不便。由于新开发的爱普利诺菌素（EPR）在肌肉中残留量低，因此，用药后不需休药期。这大大方便了用药，也有利于食品的安全。目前EPR的商品化制剂仅有Merial公司的浇泼剂Eprinex Pour-On。该制剂在防治牛（包括奶牛和肉牛）的线虫病取得了良好的效果，而且不需休药期。为了了解所研究的爱普利注射液对牛线虫的防治效果进行了本试验。     

牦牛主要寄生虫病高效低残留防治技术试验示范

为评价埃谱利诺菌素浇泼剂的驱虫效果与对牦牛线虫病及外寄生虫病的防治示范应用效果,选择1.5岁感染线虫和部分外寄生虫的牦牛150头,设埃谱利诺菌素浇泼剂0.4、0.5和0.6 mg/kg体重剂量组和埃谱利诺菌素注射剂对照组,进行驱虫效果评价;按0.5mg/kg体重剂量进行规模防治技术示范,检查防治效果和考核防治效益。结果:药效试验中埃谱利诺菌素浇泼剂0.5 mg/kg对牦牛消化道线虫虫卵转阴率、减少率分别为96.7%和99.3%,对原圆科线虫幼虫转阴率和减少率分别为90.0%和97.8%;0.6 mg/kg剂量对消化道线虫虫卵及原圆科线虫幼虫转阴率和减少率均为100.0%;0.4mg/kg剂量对消化道线虫虫卵转阴率为83.0%,减少率为90.4%,原圆科线虫幼虫转阴率和减少率分别为76.7%和88.9%。在冬季应用埃谱利诺菌素浇泼剂按0.5 mg/kg体重剂量对牦牛进行规模防治技术示范,近期防治示范群牦牛消化道线虫虫卵转阴率为96.7%,虫卵减少率为97.7%;对原圆科线虫幼虫转阴率、减少率分别为93.3%和97.6%。远期防治效果达88.5%。同期检查未防治对照组牦牛虫卵EPG和幼虫数略有增加。埃谱利诺菌素浇泼剂0.5mg/kg剂量试验组给药后第1d牦牛体表的牛颚虱活力减弱;第3d牛颚虱大部分死亡干瘪,部分虫体处于麻痹状态,活力较差;第7d检查牛颚虱全部死亡干瘪,杀灭率达100%;0.4mg/kg剂量,第3、7d检查杀灭效果次于上述剂量。而未防治的对照组牦牛上述外寄生虫活力旺盛,感染情况与给药前无明显变化。检查技术示范群比未示范群每头成年牦牛平均多增重或少减重5.76kg、幼年牛成活率平均提高2.51个百分点。结果表明该防治技术对牦牛主要寄生虫病高效安全低残留,效益显著。     

不同剂量埃普利诺菌素注射液在牛奶中的残留消除试验

本试验通过给奶牛1次皮下注射两种剂量(0.2mg/kg,0.4 mg/kg)的埃普利诺菌素(EPR)注射液后,在不同的时间点采集牛奶样品,加入多拉菌素(DOR)作为内标物,运用高效液相色谱法(HPLC)测定其中的EPR含量,获得不同剂量的EPR注射液在牛奶中的残留消除规律,以指导和规范实际生产中的合理用药.     

埃普利诺菌素研究进展

埃普利诺菌素(Eprinomectin，EPR)是一种高效、低残留的抗寄生虫药物，应用于奶牛和肉牛时无需体药期。本文就EPR的开发情况、物理化学性质、生物学特性、痕量检测、药物动力学、药剂学、药效学及毒理学等方面的研究进展进行了综述。     

牛皮下注射爱普菌素注射剂后组织残留休药期的建立

建立牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中爱普菌素残留的高效液相色谱荧光检测方法（HPLC-FLD）,并用统计学方法计算牛皮下注射爱普菌素后组织残留的休药期。牛组织样品经乙腈提取,过碱性SPE柱。组织样品添加浓度为2～100 ng·g^-1,平均回收率为70.5%～91.2%,变异系数为2.3%～11.5%;方法检测限和定量限分别为1和2 ng·g^-1。18头牛颈部皮下一次性注射爱普菌素注射液（1%）,注射剂量为200μg.kg-1体质量,分别在给药后第1、3、7、14、21、28天各屠宰3头取样,经HPLC-FLD分析。结果表明,皮下单次注射给药后,肌肉中药物残留量（2.1～9.3 ng·g^-1）低于美国规定的残留限量（10 ng·g^-1）;肝脏中药物残留量（29.8～625.1 ng·g^-1）低于美国、欧盟和CAC规定的残留限量（分别为4 800、1 500和2 000 ng·g^-1）;肾脏和脂肪中药物残留量（4.1～112.5ng·g^-1和2.1～96.4 ng·g^-1）都低于欧盟和CAC规定的残留限量（300和250 ng·g^-1）。采用欧盟官方推荐方法对残留浓度-时间数据统计分析,牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪休药期均为0 d。     

牛肝中阿维菌素类药物残留的高效液相色谱荧光检测方法的研究

采用高效液相色谱分离,荧光检测器检测,建立了固相萃取分析牛组织中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留的方法.样品用乙腈提取,碱性氧化铝和C18SPE柱净化,用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化试剂,在96℃条件下,完全衍生化需要100min.4种药物的平均回收率为70.02%～88.75%,日内变异系数小于8.52%,日间变异系数小于7.13%.埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检出限为0.4～0.5μg/kg,定量限为2ug/kg.该方法可靠、灵敏,可用于常规残留分析.     

伊维菌素浇泼剂对牦牛胃肠道线虫的驱除效果

在甘肃省肃南县大河乡大岔村选择自然感染胃肠道线虫的1-2岁牦牛75头,随机分为5组,每组15头,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别为伊维菌素浇泼剂试验组,分别按0.3、0.4、0.5 mg/kg体重剂量经背部皮肤浇泼给药;Ⅳ组为伊维菌素注射剂对照组,按0.2 mg/kg体重剂量皮下注射给药;Ⅴ组为空白对照组。另随机挑选牦牛10头供安全性观察,随机分为2组,每组5头,分别为伊维菌素浇泼剂0.7 mg/kg和1.0 mg/kg体重剂量试验组,经背部皮肤浇泼给药。结果表明：以0.5 mg/kg体重剂量伊维菌素浇泼剂对牦牛胃肠道线虫驱治效果最好,其虫卵转阴率、减少率和驱虫率分别达100%、100%和99.25%,对毛首线虫驱虫率为96.00%;0.3 mg/kg和0.4 mg/kg体重剂量伊维菌素浇泼剂的驱虫效果均低于0.5 mg/kg体重剂量组,且呈现驱虫效果随着药物剂量的增加而提高。同时,试验使用1.0 mg/kg体重剂量伊维菌素浇泼剂,所用试验牦牛给药后精神、呼吸、采食、排粪、运动等情况未见异常反应,表明本品毒性较低,临床使用安全高效。     

喹胺醇在鸡组织的消除及残留研究

以鸡为靶动物,多次口服(50 mg/kg,每12 h 1次,连续6次)喹胺醇,测定其在肝脏、肾脏及肌肉中的残留.用乙腈-乙酸乙酯(3/2,V/V)提取组织中的药物,反相高效色谱法测定组织中喹胺醇的浓度.色谱条件:C18-ODS柱(25 ㎝×4 .6),流动相为乙腈:水(2/3,V/V);流速1.0 ml/min,紫外检测波长为334 nm.鸡多次口服喹胺醇,于第6次给药后在肝脏、肾脏、肌肉药物的消除半衰期为5.91、6.489、5.727 h.若规定组织中喹胺醇浓度最高残留限量为1ng/g可食用,则休药期应为2天.     

恩诺沙星可溶性粉在北京油鸡体内残留消除规律研究

为研究恩诺沙星可溶性粉在北京油鸡体内的残留消除规律，以确定休药期，试验采用推荐剂量（75 mg/L）和2倍推荐剂量（150 mg/L）恩诺沙星自由饮水方式连续对北京油鸡给药5 d，在最后一次给药后0（停药后4 h）、1、3、5、7、9、12和15 d，采集北京油鸡肝脏、肾脏、肌肉和脂肪，采用高效液相色谱串联质谱法测定各组织中的恩诺沙星及其代谢物环丙沙星的残留量，并用WT1.4软件计算休药期。结果显示，推荐剂量5%恩诺沙星可溶性粉在北京油鸡各组织的休药期分别为肝脏7.1 d、肌肉3.8 d、肾脏5.2 d、脂肪4.4 d,2倍推荐剂量的休药期分别为肝脏9.6 d、肌肉4.2 d、肾脏6.4 d和脂肪8.4 d。结果表明，恩诺沙星在北京油鸡的休药期可设置为8 d。     

喹烯酮在猪组织中的残留研究

目的 :建立起定量测定猪肝脏、肾脏、肌肉、脂肪食用组织中喹烯酮的高效液相色谱检测方法 ,依据测定的结果制定最高残留限量 ,定出其休药期。方法 :猪 45头 ,公母各半 ,按正常饲料添加喹烯酮 50 mg/ kg饲喂 2 .5月后 ,分别于4h、1 d、2 d、3 d、4d、6d、8d、1 2 d、1 5d采样。检测采用 Prodigy5μ Phenyl-3色谱分析柱 (4.6mm× 2 50 mm5μm icron) ,Waters TM486可变波长紫外检测器 ,甲醇 -水 (70∶ 3 0 )为流动相。组织样品用乙酸乙酯、乙腈、正已烷、氯仿等试剂提取处理纯化后进样 ,在 3 1 2 nm波长处检测 ,流速为 1 .0 m L·min- 1。结果 :标准曲线的线性范围为 :脂肪、肝脏 ,0 .0 0 5～ 0 .80 0μg· g- 1;肾脏、肌肉 ,0 .0 0 8～ 0 .0 80μg· g- 1。它们的复相关系数均大于 0 .99。精密度考察喹烯酮的日内各组织各浓度的 RSD(相对标准差 )均小于1 2 % ,日间测得各组织各浓度的 RSD均小于1 8.5%。喹烯酮在肌肉、脂肪、肾脏中均无残留 ,而在肝脏中的残留量也很小 ,4d以后再无残留。结论 :本试验测定方法灵敏度高 ,重复性好。停药后 4h所有可食用猪组织中喹烯酮浓度均低于计算所得的安全组织浓度 ,故该药在猪使用上无休药期 ,即休药期为零天。     

喹烯酮在鸡食用组织中的残留研究

为建立定量测定鸡食用组织中喹烯酮的高效液相色谱检测方法,并依据测定的结果制定最高残留限量,确定其休药期。选用63只鸡,按正常饲料添加喹烯酮(75 mg/kg)饲喂2.5月后,按既定时间点采样。组织样品用乙酸乙酯等试剂提取处理纯化后进样,在312 nm波长处检测,流动相为甲醇-水(70∶30),流速为1.0 mL/min。结果表明,在试验条件下,脂肪、肝脏、肾脏、肌肉组织中的最低检出浓度均为0.005μg/g。平均回收率肌肉为99.23%±2.75%,脂肪为105.15%±8.65%;肝脏为93.55%±11.16%;肾脏为104.10%±9.80%。喹烯酮在肌肉皮脂中1 d后均无残留,而在肝脏和肾脏中的残留量也很小,2 d以后再无残留。精密度考察喹烯酮的日内和日间各组织各浓度的相对标准差均小于8.5%。因此,本试验测定方法灵敏度高,重复性好。停药后4 h所有可食用鸡组织中喹烯酮浓度均低于计算所得的安全组织浓度,故该药在鸡上使用无休药期,即休药期为0 d。     

盐酸多西环素注射液在猪体内残留消除规律研究

为研究自制盐酸多西环素注射液在猪体内的残留消除规律,以10 mg/kg剂量给健康猪肌内注射盐酸多西环素注射液,每日1次给药,连续三次。在最后一次给药后7、14、21、28和35 d时间点采集肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉,用UPLC-MS/MS法测定组织中多西环素残留量。结果表明,给药35 d后,肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉中的多西环素残留量分别为18、24、69、10、59μg/kg,均低于最高残留限量。用WT1.4软件计算休药期,盐酸多西环素注射液在猪肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉中的休药期分别为33.9、23.8、24.8、0和36.9 d,为保证兽药安全使用、消费者身体健康与食品安全,建议盐酸多西环素注射液在猪的休药期为42 d。     

埃谱利诺菌素浇泼剂对绵羊消化道线虫的驱虫效果评价5-6

为评价埃谱利诺菌素浇泼剂对绵羊消化道线虫驱虫效力,选择1.5岁自然感染消化道线虫的绵羊100只,随机分为5组,每组20只,1～3组为埃谱利诺菌素浇泼剂0.4、0.5和0.6mg/kg.b w组,沿背部皮肤中线浇注给药,4组为埃谱利诺菌素注射剂药物对照组,按0.2mg/kg剂量颈部皮下注射,5组为阳性对照组,不给药;采用粪便虫卵检查法评价驱虫效果。结果:给药后7、14d检查,0.5mg/kg剂量对消化道线虫虫卵转阴率分别为90.0%、95.0%,减少率分别为97.0%和99.3%; 0.6mg/kg剂量给药后7、14d检查,对消化道线虫虫卵转阴率、减少率均达100.0%; 0.4mg/kg剂量对消化道线虫虫卵的转阴率、减少率均低于0.5、0.6mg/kg剂量组。对照药物埃谱利诺菌素注射剂0.2mg/kg剂量组对消化道线虫的驱虫效果略高于埃谱利诺菌素浇泼剂0.5mg/kg剂量组;埃谱利诺菌浇泼剂3个剂量组试验绵羊未见异常反应。试验证明埃谱利诺菌浇泼剂0.4、0.5、0.6mg/kg体重剂量驱除绵羊消化道线虫安全有效,其中0.5、0.6mg/kg剂量高效安全低残留,推荐剂量以0.5mg/kg为宜。     

烯丙孕素口服液在猪体内的残留消除研究

本研究旨在分析烯丙孕素在猪体内的残留消除规律,为制定休药期提供依据。采集猪肝、肾、肌肉和脂肪样品,肝、肾样品经β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解,然后用乙腈提取(肌肉和脂肪样品直接用乙腈提取),乙腈饱和正己烷溶液除脂,氮吹后残渣用乙酸乙酯复溶,后用10%碳酸钠溶液净化进行LC-MS/MS分析,外标法定量。结果表明:在1~200ng·mL~(-1)浓度范围内,烯丙孕素具有良好的线性关系,相关系数大于0.999,方法的检测限为0.5μg·kg~(-1),定量限为1μg·kg~(-1);在1、100、200μg·kg~(-1)添加水平下,化合物的平均回收率在68.9%~78.9%,相对标准偏差均小于11%。试验猪按0.4mg·kg~(-1)剂量内服给药,每天1次,连续给药18d,经取材检测,休药6h后各组织中烯丙孕素残留量最高,休药后第5天脂肪中烯丙孕素残留量低于最大残留限量,肌肉、肾中残留量低于定量限,休药第10天所有组织中烯丙孕素残留量均低于定量限。休药后相同时间点猪组织中烯丙孕素残留量规律为肝肾脂肪肌肉;肝中烯丙孕素消除缓慢且消除时间最长。根据WT1.4软件按99%置信区间计算所得,建议母猪按0.4mg·kg~(-1)剂量内服给药,每天1次,连续18d,其休药期为9d。