一步法RT-PCR快速检测鸡新城疫病毒强毒株

本文参照NDV融合蛋白(F)基因序列设计引物,通过一步法RT-PCR扩增到NDV强毒株的170bp大小的特异条带。试验中未检出NDV弱毒株、IBV、AIV、IBDV的RNA,能够检出NDV尿囊液毒的最低滴度为10-5稀释度(相当于103.7EID50病毒量)。对山东省不同地区于1997至2003年所分离的21个NDV强毒株检测全为阳性,而6个NDV弱毒株全为阴性。整个实验操作从病毒核酸提取到判定结果,在5h内即可完成。实验结果表明,该方法特异、敏感,适用于强毒感染鸡群的快速检测     

一步法RT-PCR快速检测鸡新城疫病毒强毒株

本文参照NDV融合蛋白(F)基因序列设计引物，通过一步法RT-PCR扩增到NDV强毒株的170bp大小的特异条带。试验中未检出NDV弱毒株、IBV、AIV、IBDV的RNA，能够检出NDV尿囊液毒的最低滴度为10^-5稀释度(相当于10^3.7EID50病毒量)。对山东省不同地区于1997至2003年所分离的21个NDV强毒株检测全为阳性，而6个NDV弱毒株全为阴性。整个实验操作从病毒核酸提取到判定结果，在5h内即可完成。实验结果表明，该方法特异、敏感，适用于NDV强毒感染鸡群的快速检测。     

鹅源新城疫病毒自然弱毒株的分离与鉴定

从江苏省某健康鹅群分离并筛选出一株病毒,经鸡胚传代培养和血清学试验,证明该毒株为新城疫病毒。应用电镜技术、生物学特性检测对其进行鉴定,结果表明:该毒株MDT为146.4h,ICPI为0.375,参照判定标准,确定该毒株为NDV弱毒株。通过RT-PCR方法,扩增出该毒株F基因,并进行克隆和序列测定,其F蛋白裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,符合典型的NDV弱毒株的特征,从基因和分子水平上进一步证明该毒株为NDV弱毒株,通过绘制的系统发育进化树进行分析,表明该毒株为F基因Ⅰ型新城疫病毒,并将该毒株暂命名为G0405。     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。     

强毒鸡新城疫病毒的分离鉴定及免疫防制研究

从陕西发病鸡群中分离出8株病毒，分离毒大多为速发型NDV强毒株，对经典NDV La Sota株免疫的雏鸡及52周龄高抗体母鸡仍有强的致病力，采用NDV SH1－SH8病株制备成多价油乳剂灭活苗，免疫鸡群有良好的保护力。     

新城疫病毒西藏分离株的生物学特性鉴定及遗传进化分析

从西藏病死藏鸡中分离到具有血凝活性的病毒、经血凝抑制试验、电镜观察、PCR扩增和测序鉴定为新城疫病病毒(NDV),通过动物致病性试验证明该病毒对鸡具有致病性;分离毒株毒力测定结果显示,MDT为120h,EID50为10-8.44、IVPI为0.5、ICPI为0.6,均符合NDV弱毒株特征。血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示:各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差,符合NDV弱毒株的特征。F基因的序列测定遗传进化分析表明,西藏分离毒株之间的核苷酸序列具有99%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性为90%;与国内标准强毒株F48E8同源性为81%。推导其氨基酸序列分析表明,各分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸112 G-K-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株特征,与毒力测定结果相符。本研究首次报道了NDV西藏分离毒株遗传进化情况和生物学特性情况,为进一步研究高海拔、缺氧环境下NDV生物学特性变化研究奠定了基础。     

以rLaSota为骨架构建表达强毒株HN蛋白的嵌合体新城疫病毒

新城疫病毒(NDV)的HN蛋白是一个多功能蛋白,具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,在病毒感染过程中扮演重要角色。本研究利用反向遗传操作技术,将NDV强毒株F48E9的HN基因替换弱毒株rLaSota的HN基因,获得嵌合病毒rL-F48E9HN。收获病毒尿囊液,提取基因组RNA,进行序列分析,结果显示嵌合病毒基因组的HN基因获得了正确替换。嵌合病毒在鸡胚内的生长特性与亲本株LaSota一致,与F48E9的生长特性相差甚远。嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,较rLaSota株增加51%,而细胞融合作用无明显变化。rL-F48E9HN的鸡胚平均致死时间(MDT)为148 h,脑内致病指数(ICPI)为0.43,静脉接种致病指数(IVPI)为0,说明rL-F48E9HN的毒力仍然属于弱毒力范围,而没有达到中等毒力或者强毒力。     

NDV地方分离株的分离鉴定及生物学特性研究

从发病率为 100％、病死率为 97％的鸡群中分离到一株病毒。该病毒可凝集鸡的红细胞，血凝价为 28～ 10，且此凝集作用可被新城疫标准阳性血清所抑制，证明所分离的病毒为新城疫病毒。经回归试验、 MDT、 EID50、 ICPI等生物学特性研究表明，该病毒为 NDV强毒株，命名为 NL株。     

病毒样颗粒疫苗可能用于控制鸡新城疫

正韩国建国大学的科研人员应用昆虫细胞表达系统研制出表达新城疫病毒(NDV)F蛋白和流感病毒M1蛋白的NDV病毒样颗粒(VLP)。SPF鸡分别免疫含不同剂量VLP(0.8、4、20、100μg/mL)的NDV VLP油乳剂疫苗。免疫3周后,应用商品化ELISA试剂盒检测NDV VLP疫苗的免疫力;同时用NDV强毒株进行攻毒试验以评估NDV VLP疫苗对SPF鸡的保护效果。结果显示,NDV VLP疫苗免疫后可产生大量抗NDV的抗体,且SPF鸡对NDV强毒株的抵抗力与NDV VLP疫苗免疫剂量相关。尽管含0.8、4μg/mL VLP的NDV VLP疫苗不能     

鸭副粘病毒强毒株的分离和鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病肉鸭群中分离到一株病毒。该素株对鸡红细胞具有凝集性，并可被康复鸭鸭血清和NDV阳性抗血清所抑制，而不能被禽流感标准阳性血清抑制，结合血清中和鸡胚接种试验，病毒回归试验和免疫防治效果的研究结果，确认为鸭副粘病毒。参照国际上规定的新城疫病毒毒力判定的标准及其方法，测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT），1日龄鸡及脑内接种致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉内接种致病指数（IVPI）分别为48.9h,1.80和2．45。表明该鸭副粘病天线离株具有新城疫病毒（NDV）速发型相类似的毒力，属强毒力毒株，并定名为WF00D株。     

新城疫强、弱毒株分子生物学鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别区分新城疫强、弱毒株,根据新城疫病毒F基因序列设计出并合成两对特异性引物,XsXq、XrXa,用来区分新城疫强毒株和弱毒株,其中XsXa可组合用来扩增新城疫所有毒株,利用这三对引物对新城疫病毒的F基因片段进行多联RT—PCR扩增,并对该多联RT—PCR检-测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明：这三对引物能特异性地扩增出新城疫强、弱毒株及NDV毒株的F基因片段,大小分别为259bpNDV（F48E9）、522bpNDV（LaSota）、757bp（NDV）,该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速、敏感、特异的鉴别诊断新城疫强、弱毒株的分子诊断方法。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒（NDV）对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因III型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株．以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品,以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量。结果表明,6株基因Ⅶd亚型NDV毒株导致SPF鸡100％发病,死亡率90％以上,     

新城疫病毒强弱毒株检测方法研究进展

一. NDV毒力的分子生物学基础 　　NDV是单链 RNA病毒，基因组长度为 15156个核苷酸，分子量为 (5.1－ 5.7)× 106Da，裂解的纯化病毒颗粒经 PAGE揭示其至少编码 7种多肽。其基因组编码 6种蛋白质： L、 P、 HN、 F、 NP、 M蛋白。各种结构蛋白基因在基因组上的排列顺序为： 3’－ NP－ P－ M－ F0－ HN－ L－ 5’。 L、 NP和 P三种蛋白称为衣壳蛋白，它们的主要功能是参与病毒的合成。 M蛋白在 RNA的合成和病毒的自身装配中起重要作用。 HN的作用是使病毒吸附于细胞受体，并通过血凝素和神经氨酸酶这两种生物活性物质破坏…     

检测鸵鸟血清中新城疫病毒特异抗体的方法比较

近向年，一些平胸鸟类（如鸵鸟、鸸鹋）的饲养和贸易已扩展到世界各地。这些鸟类对几种家禽疾病，如新城疫等非常易感。目前已从南非鸵鸟血清中分离到的14株新城疫病毒（NDV）的特性表明，这些鸵鸟携带有疫苗株病毒（如Lasota）和一定数量的野毒株。因此，鸵鸟可能会成为NDV的携带者并散毒。故对进口的一些鸟类如各种家禽应进行血清学检查，结果呈阳性的应通过病毒分离进行证实。     

基因Ⅶ型NDV强毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析

运用一步法RT-PCR扩增两株高致病力NDV分离株的F基因重要功能区,并进行序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点氨基酸顺序均为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符,且具有101位的K(赖氨酸)和121位V(缬氨酸)两个特征性氨基酸,与基因Ⅶ型NDV的特征完全相符[1]。与疫苗株lasota进行序列比较,并构建了系统发育树,结果表明两株病毒核苷酸同源性达96.6%,与lasota同源性为63.7%,从分子水平揭示了这两个毒株抗原性与常用疫苗株Lasota差异较大的原因。     

不同禽源新城疫病毒强毒株对鹅的致病性研究

分别采用鸽、鸡、鸭、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒株和NDV国内标准强毒株F48E8进行鹅的人工感染试验,对感染鹅的临床症状、增重、抗体水平和排毒情况进行详细观察,探讨不同禽源NDV强毒株对鹅的致病性以及鹅在家禽新城疫(ND)流行中的意义。结果表明,鸽源强毒株JSP0204对鹅无致病性或致病性很弱,感染鹅未表现临床症状,增重也未受到显著影响(P0.05)。而鸡源JSC0804、鸭源JSD0812、鹅源JSG0210和F48E8株均可致鹅发病和死亡,尤以鸭源JSD0812和F48E8株致病性最强,致死率高达100%。所有感染鹅均可排毒,排毒时间因毒株不同而异。研究结果表明目前流行的NDV强毒株对鹅的致病性普遍增强,并进一步证实鹅在ND流行病学中具有重要的作用。     

一株鸡新城疫流行毒株的分离鉴定及油乳剂灭活苗免疫效果评价

鸡新城疫(ND)是严重危害我国养鸡业的重要疫病之一,每年造成巨大的经济损失.其病原为新城疫病毒(NDV),属于副粘病毒科副粘病毒属.     

鹅源新城疫病毒单克隆抗体的研制及其与不同NDV毒株的反应性

以鹅源新城疫病毒(NDV)作为免疫原免疫BALB／c小鼠，获得了5株具有HI特性的单克隆抗体，分别命名为2G5、3A4、385、6B1和8C5，其腹水HI效价分别为2^14、2^12、2^9、2^15和2^8。竞争ELISA结果表明，2G5、3A4、385和6B1在HN蛋白上所针对的表位属于同一抗原区，而8C5针对的表位为另一抗原区。将上述5株单抗与不同来源的NDV进行了HI排谱试验。结果显示，同一抗原区4株单抗的反应谱比较一致，而与另一抗原区单抗8C5的反应谱明显不同。5株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强，而与鸽源NDV毒株的反应性较弱。这5株单抗用HRP标记后再与不同单抗进行交叉夹心ELISA，得到了一个新的系统(2G5—8C5)。用该系统对NDV分离株做排谱试验。结果显示，该系统与鹅源NDV分离株的反应性较好，表明所建立的新系统可用于鹅源NDV的检测。     

免疫鸡群病鸡脑组织中2株NDV弱毒株分离鉴定

湖北某鸡场15000余只肉用杂交麻鸡先后2批发生呼吸道症状为主的疾病．死亡鸡主要病理变化为消化道斑状出血，气管充血出血，个别鸡腺胃乳头出血，取病鸡脑组织进行病原分离，分离2株新城疫病毒（NDV）。并对其致病指数进行了测定，结果为：鸡胚平均致死时间（MDT）为120h，脑内致病指数（ICPI）为0．18～0．21，静脉接种致病指数（IVPI）为0．2～0．4。根据国际有关NDV毒力标准，分离的2株病毒为弱毒株。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。