表达MERS-CoVS1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)纯化方法的建立

建立一种可线性放大、应用于表达中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)S1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)的规模化纯化方法。将收获的病毒去除细胞碎片、灭活后,分别通过3种方法(醋酸锌沉淀+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 000中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 000中空纤维超滤柱+Cellufine~(TM )Sulfate亲和层析)进行纯化,经比较筛选出一种温和、目的蛋白回收率高、纯度高的纯化方法。结果显示,500 000中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析回收的抗原含量最高,50 mL重组病毒原液经纯化后可得到1.82 mg蛋白,杂蛋白去除率达到97.02%,病毒纯度较高,电镜下可见到病毒囊膜刺突。结合成本等方面综合考虑,此方法优于其他2种纯化方法。本试验筛选获得了一种适用于rSRV9-MERS_(S1)的纯化方法,为rSRV9-MERS_(S1)规模化纯化工艺的建立与MERS新型疫苗的研制奠定了基础。     

菌丝霉素NZ2114毕赤酵母工程菌高效发酵工艺的研究

抗菌肽是饲料中广泛使用的药物抗生素的有效替代品之一。菌丝霉素作为一种革兰氏阳性菌抗菌肽,其活性研究已积累较多数据,但发酵工艺摸索还少见报道。重组菌丝霉素酵母工程菌的高效表达是后续能否进行大规模生产的瓶颈之一。本文通过培养基配方,接种条件,甲醇诱导和流加方式,菌体湿重几个方面入手,探讨了对重组菌丝霉素蛋白表达量影响的主要因素,得出使用BSM培养基,接种量为15%,甲醇诱导48小时,湿重达到300g/L时,菌丝霉素的表达量最高,活性最佳,同时经济成本也可得到相应控制。本研究为后续重组菌丝霉素的生产提供了理论和试验数据支撑。     

3种方法纯化兔抗H9N2亚型禽流感病毒血清的比较

本试验分别用蛋白G亲和层析法、饱和硫酸铵法和辛酸-硫酸铵法纯化兔抗H9N2亚型禽流感病毒血清,发现蛋白G亲和层析法纯化得到的抗体纯度最高,回收率较低,抗体活性未变,操作简便,但成本较高,适合实验室研究及小量样品的纯化;饱和硫酸铵法纯化得到的抗体纯度较蛋白G亲和层析法低一些,抗体活性不变,可通过多次盐析来提高抗体纯度,多作为蛋白G亲和层析法纯化前的初步纯化;辛酸-硫酸铵法纯化得到的抗体纯度不及前两种方法,回收率较高,抗体活性亦无改变,纯化时对pH的精确性和辛酸的浓度要求较高,多用于样品的粗提和单抗的纯化。     

铁蛋白Ferritin原核表达和纯化及纳米颗粒胞外自组装

旨在使用原核表达系统表达幽门螺杆菌铁蛋白Ferritin,获得具有天然纳米结构的铁蛋白纳米颗粒,从而通过表面修饰等方法应用于疾病治疗和抗原呈递等研究。将铁蛋白氨基酸序列按照大肠杆菌常用密码子进行优化,合成重组铁蛋白基因并克隆至原核表达载体。使用镍柱进行亲和层析纯化重组蛋白,并在透析复性后利用透射电子显微镜对体外自组装纳米颗粒进行鉴定。结果显示,本研究成功构建了pET-32a-Ferritin原核表达载体,并使用IPTG进行诱导表达获得His-Ferritin重组铁蛋白,且主要以包涵体形式存在。通过镍柱进行亲和层析纯化获得纯度为96%的重组蛋白,使用脱盐柱将重组蛋白梯度透析至2mol·L-1尿素缓冲液中进行复性后,使用电子显微镜观察胞外自组装重组蛋白为粒径在12~20nm的均一的纳米结构,与天然铁蛋白纳米粒子类似。本研究成功建立了Ferritin蛋白原核表达体系,通过诱导表达、亲和层析纯化及复性获得了具有天然纳米结构的铁蛋白纳米颗粒,为其在生物医药领域的应用奠定基础。     

H5N1亚型禽流感基质蛋白M1基因的原核表达和纯化

为获得纯度大于90%的M1蛋白,构建重组质粒PET-22b-M1,将正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测分析表达形式和表达量,并经Ni2+柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白。结果表明:试验成功构建了pET-22b-M1表达载体;IPTG诱导后高效表达出分子质量约为28 ku的M1融合蛋白;纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,且获得的M1蛋白纯度达95.4%。     

肉鸡硫氧还蛋白原核表达载体的构建、蛋白纯化及其活性鉴定

根据GenBank中肉鸡硫氧还蛋白(Trx)基因的cDNA序列及载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行Trx克隆和原核表达载体的构建,并在大肠杆菌中表达。应用镍柱亲和层析对该融合蛋白进行纯化;采用胰岛素还原法对重组Trx进行活性鉴定。结果显示:成功构建了pET28a-Trx重组质粒,纯化的目的蛋白纯度可达到90%,质量浓度为4g/L。纯化的重组Trx(GgTrx)具有较高的还原胰岛素二硫键能力,并且呈现出浓度依赖效应。本研究为Trx蛋白应用于治疗氧化应激性疾病奠定了基础。     

两种方法纯化猪血清免疫球蛋白IgG的比较

为了从猪血清中纯化免疫球蛋白IgG,得到纯度更高的样品,采用饱和硫酸铵分级沉淀和Protein G柱吸附分离两种方法进行纯化,将获得的IgG经SDS-PAGE凝胶电泳纯度鉴定和HPLC浓度测定,结果表明,利用Protein G柱吸附分离纯化出的样品在纯度和浓度方面都要高于盐析法,Protein G柱吸附分离纯化IgG更适合于实验室小规模的操作,能够获得纯度高的样品。     

鸡胸腺素β_4基因的克隆与原核表达

为了找到一种能经济、简便获得胸腺素β4(Tβ4)活性蛋白的方法,试验利用基因工程的方法原核表达重组鸡Tβ4串联体(2Tβ4)并对其进行克隆。将鸡Tβ4串联体基因克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,采用免疫印迹方法对重组蛋白进行鉴定。结果表明:获得了纯化的重组2Tβ4蛋白,并具有生物学活性。说明成功构建、表达和纯化了2Tβ4。     

猪补体C5a蛋白表达、纯化和生物学活性检测

参照NCBI中公布的猪补体C5a蛋白氨基酸序列及猪C5蛋白的全基因序列,通过生物信息学分析获得猪C5a蛋白基因全长,为222 bp,该序列定向插入原核表达载体p ET-28a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western-blotting检测分析表明,C5a基因获得表达,重组蛋白大小为10 000。利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化后,体外细胞试验测定重组C5a蛋白生物学活性。结果显示,成功构建了p ET-28a-C5a重组质粒,纯化获得目的蛋白纯度达到90%以上,质量浓度为2.5 g/L。细胞试验检测到C5a具有趋化和诱导中性粒细胞的活性。本研究为揭示猪C5a参与炎症过程的作用机制及制备C5a拮抗剂奠定了基础。     

犬α干扰素的原核表达及活性检测

本研究合成了编码CaIFN-α蛋白的基因片段,分别与温度诱导表达载体pBV220和化学诱导表达载体pET20b连接,构建了pBV220-CaIFN-α和pET20b-CaIFN-α重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21,通过温度诱导和IPTG诱导表达,CaIFN-α蛋白表达量分别为25%和20%。对比两方法诱导表达结果,确定最佳诱导方法为温度诱导。表达菌经超声破碎、变性、复性、疏水层析和分子筛层析后,得纯化的CaIFN-α蛋白,纯度约为96%。利用MDCK(犬肾细胞)-VSV(水疱性口炎病毒)体系,测定纯化后CaIFN-α蛋白的生物学比活性为3×107U/mg。     

水貂细小病毒单克隆抗体的制备及纯化方法的优化

为了制备并筛选出效价及特异性都较高的水貂细小病毒单克隆抗体,建立一种高纯度、高回收率的水貂细小病毒单克隆抗体的纯化方法,试验将获得的3株稳定分泌水貂细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为G2a-C9、M-C1、M-A5,通过HI、ELISA、Western-blot、间接免疫荧光等方法对这3株单克隆抗体进行生物学特性鉴定,再分别采用辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析两种方法对其纯化,并对Protein A亲和层析法进行了优化。结果表明:经生物学特性鉴定后筛选到1株效价与生物学活性都较高的Ig G2a类单克隆抗体G2a-C9,经Protein A亲和层析方法纯化后抗体纯度为90%,回收率为58%;辛酸-硫酸铵沉淀后的抗体纯度仅为80%,回收率为45%。纯化方法优化后,抗体纯度为95%,回收率为65%。说明制备的G2a-C9水貂细胞病毒单克隆抗体可用于后续产品的研发;经试验验证低温无水乙醇沉淀-Protein A亲和层析可用于Ig G2a类抗体纯化。     

奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体.本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测.结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37 ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1:12 800.结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取、纯化及含量检测

本试验通过提取和纯化方法的优化,旨在获得高纯度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。首先将禾谷镰刀菌孢子液接种于玉米培养基,于27℃30%湿度的条件下培养25d,收集产毒培养基,制成毒素粗提液。经过层析柱2次洗脱,分段收集洗脱液,用薄层色谱法(TLC)确定含DON的洗脱液,合并洗脱液,运用多重结晶法进行纯化,获得DON的纯品,高效液相色谱法(HPLC)进行分析确认。采用该培养方法,每千克玉米培养基可产生DON 56.65 mg,纯化后可得到DON 29.5mg,纯度达到98.1%;HPLC检测条件为:Waters C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为乙腈-水(16∶84),流速0.8mL/min,紫外波长218nm,色谱柱柱温30℃;本方法加标回收率为86.9%~100.6%,日内相对标准偏差≤9.42%,日间相对标准偏差≤5.79%。本试验建立的DON提取与纯化方法简单,不需要任何特殊的试剂与设备,且该检测方法回收率高,准确度和精密度均能满足试验要求,为DON纯品的定量提供了技术支撑。     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2） Cap蛋白的病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap （PCV2 rCap）蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜（TEM）观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。     

蓝舌病Ⅰ型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25℃、诱导6 h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。     

A型肉毒毒素Hc基因的原核表达、纯化及单抗的制备

在大肠埃希茵中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原,是以包涵体形式存在.溶解后的包涵体溶液经过处理,用镍柱亲和层析法纯化,得到纯度约为90%的融合蛋白.利用纯化的重组抗原BoNTa免疫Balb/c小鼠,获得分泌抗BoNTa特异性的3株杂交瘤细胞株2A2、4F7和2A8,其单抗鉴定均为IgG1亚型,滴度达到1:105.高纯度和活性单抗的获得为毒素检测试剂盒的研究奠定了基础.     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。     

非洲猪瘟病毒无标签重组B602L抗原制备与鉴定

为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。