一株H5N3亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。     

1株野鸟源H7N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠感染性研究

旨在对2021年分离自我国宁夏回族自治区野鸟粪便中的1株低致病性H7N3禽流感病毒(AIV)A/mallard/Ningxia/Y37/2021(H7N3)株进行了全基因组测序、遗传进化分析及对小鼠致病性试验。全基因组序列分析表明，HA基因裂解位点仅有1个碱性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特性。遗传进化分析结果表明，HA基因和韩国野鸭源H7N7亚型AIV同源性较高；NA基因与韩国野鸟源H5N3亚型AIV同源性较高；PB2、PA基因与H5N2亚型AIV有较高的同源性；PB1基因与H5N3亚型AIV有较高的同源性；NP基因与H3N2亚型有较高同源性；M、NS基因与H3N8亚型有较高同源性，具有明显的遗传多样性。血凝抑制(HI)试验结果表明，该毒株与H7N9-Re4疫苗株抗血清的HI效价比同源毒株低16倍，抗原性差异显著。小鼠感染性试验结果显示，该病毒能在小鼠的肺部与鼻甲中复制，并引起感染小鼠体重下降，表明该毒株有感染哺乳动物的风险。本试验通过对1株野鸟源H7N3亚型AIV部分生物学特性的分析，为H7N3亚型禽流感的预警和综合防控提供重要理论参考。     

一株H10N1亚型禽流感病毒的遗传演化及其对小鼠的感染性研究

为了解从湖南省某活禽市场分离的一株鸭源H10N1亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hunan/S10078/2015(H10N1)(简称Hu N/78/15)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列的测定及遗传演化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染试验。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点只含有一个碱性氨基酸,为低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。遗传演化分析结果表明该病毒的HA基因与NA基因分别来源于H10N7与H5N1亚型AIV,内部基因来源于H7N9、H4N6、H3N2、H11N7亚型AIV,呈现明显的遗传多样性。小鼠感染试验结果显示,Hu N/78/15能够在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,但仅引起小鼠轻微的体重变化,表明其对小鼠呈低致病性。本研究结果为H10亚型AIV的持续监测和生物学特性研究提供相应的参考依据。     

高通量测序一株天鹅源H5N8亚型流感病毒遗传演化分析

为研究一株天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化规律,本研究对2016年从山西省疾控中心送检天鹅样品中分离到的一株H5N8亚型流感病毒(A/swan/Shanxi/6/2016)的全基因组序列进行高通量测序及遗传演化分析。结果显示,分离的病毒为Clade 2.3.4.4分支高致病禽流感病毒(HPAIV);BLAST分析显示该分离株的NP基因与H3N8亚型AIV的NP基因具有较高同源性,而其它基因节段则分别与来自其它国家的H5N8亚型AIV的相应基因节段同源性较高,进一步选取与各基因节段核苷酸同源性较高的病毒株作参考序列构建其系统进化树,推测该分离株为一株重组病毒株。特殊氨基酸位点分析显示,其具有典型的禽型受体结合位点和典型的人型受体结合位点。并且M1蛋白、NS1蛋白和PB2蛋白具有H5N1亚型AIV对鼠致病性增强的分子标志,提示该株野鸟源流感病毒可能具备感染哺乳动物的能力。本研究对H5N8亚型AIV的综合防控具有一定的指导意义。     

一株H6N6亚型野鸟禽流感病毒全基因组序列分析以及对小鼠的感染性研究

为进一步了解2015年分离于我国新疆野鸟粪便中的一株H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/WB/XJ/S1541/2015(H6N6)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组测序、遗传演化分析以及BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示:该分离株HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为~(339)PQIETR↓GL~(346),仅有1个碱性氨基酸,具有低致病性AIV的分子特征。此外,分离株表面基因HA、NA均与一株H6N6亚型猪流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010高度同源,而内部基因均与H6N6亚型AIV A/pigeon/Guangxi/161/2014(H6N6)高度同源,提示该分离株基因来源的多样性。小鼠的感染性试验结果显示:该病毒可在小鼠的肺脏和鼻甲中有效复制,病毒滴度分别为5.33 log_(10) EID_(50)/mL、4.50 log10EID50/m L,提示其具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究结果为H6亚型AIV的持续性监测和相关生物学特性的研究奠定基础。     

两株H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列测定及其对小鼠的感染性研究

为了解2015年广西地区活禽市场中的两株鸡源H9亚型禽流感病毒(AIV)A/chicken/GX/S30272/2015(H9N2)(简称GX/272/15株)和A/chicken/GX/S30825/2015(H9N2)(GX/825/15株)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组序列测定和小鼠的感染性试验。核苷酸序列分析表明,两株病毒的HA基因发生了I~(155)T、H~(183)N、A~(190)T和Q~(226)L突变,这些突变与增强病毒的人源受体结合特性密切相关。遗传演化关系表明,两株病毒的HA基因均属于欧亚分支Beijing/1/94谱系。GX/272/15株的8个基因节段和GX/825/15株的HA节段来源于H9N2 AIV,GX/825/15株的其余7个基因节段分别来源于H4N2、H10N6、H7N9、H7N1、H9N2、H6N6和H3N2多种不同亚型的AIV。两株病毒均可感染小鼠,且均不需要经过适应即可在小鼠的鼻甲内进行复制。但仅GX/825/15可以在小鼠的肺脏内复制。两株病毒均未造成小鼠死亡,仅引起小鼠体重的轻微变化,对小鼠呈低致病力。本研究结果表明,H9N2亚型AIV能够感染哺乳动物,应加强后续分离病毒对人类健康危害性的评估。     

一株低致病力H5N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对从我国广西省鸭体内分离到的一株低致病力H5N3亚型AIV DK/GX/S11453/2019(H5N3)进行了全基因组序列分析、抗原性分析、对小鼠的感染性以及受体结合特性分析。全基因组序列分析显示,该病毒的基因具有明显的野鸟源性,该病毒除HA与NA来源相同外,其余片段均来源不同,具有明显的遗传多样性。HA蛋白的裂解位点仅含有一个碱性氨基酸,符合低致病力AIV的分子特征。抗原性分析结果显示该病毒分离株与近几年国内使用的各疫苗株的抗原差异性较大。小鼠感染性试验结果显示,该病毒对小鼠呈现低致病力,不引起小鼠明显的体质量下降,但可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效的复制。受体结合特性分析结果显示,该病毒具有同时结合α-2, 3和α-2, 6受体的能力,存在一定感染哺乳动物的风险。本研究通过对该H5N3亚型AIV部分生物学特性的分析,为H5N3亚型禽流感的防控提供理论依据。     

14株H3亚型禽流感病毒全基因组序列分析

为了解2016年至2017年在我国部分省市活禽市场的家禽体内分离得到的14株H3亚型禽流感病毒的流行情况和遗传特点。采用RT-PCR技术对这14株H3亚型禽流感毒株的全基因进行扩增,并对所得序列进行遗传演化分析。14株分离株中有5株H3N8,7株H3N2,2株H3N3。结果表明,14株毒株中AIV的HA蛋白的裂解位点氨基酸序列均为PE-KQTR↓GLF,只有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感的分子特征。HA基因的受体结合位点为226(Q)、228(G)具有典型的禽源特征。遗传进化分析表明,除了毒株A/Duck/Fujian/F1142/2016(H3N8)的NS基因属于北美分支外,其余毒株全部基因均属于欧亚分支。通过对H3亚型AIV的遗传进化关系和流行情况进行分析,以期对H3亚型AIV的进化研究提供一些参考依据。     

一株鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Jilin/7/2015(H9N2)的遗传进化分析和致病性研究

为探究从死亡鹌鹑肺脏分离鉴定出的1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/quail/Jilin/7/2015(简称QA/JL/7/15)在流感病毒生态分布中的进化关系,本研究对QA/JL/7/15株进行了全基因序列测定,并结合Gen Bank中登录的代表性H9N2亚型流感病毒的基因组序列及其它参考株序列进行了遗传进化分析。结果显示,QA/JL/7/15为一株重组病毒,血凝素基因(HA)来自A/chicken/Jiangsu/1/00类病毒株;神经氨酸酶(NA)来自A/chicken/Guangxi/KMIII/1999类病毒株;PB2基因来自A/duck/Shantou/163/2004类病毒株;PB1、PA、NP和NS基因来自A/chicken/Shanghai/F/98类病毒株;M基因来自A/Quail/Hong Kong/G1/97类病毒株。HA基因与近年中国湖北分离株A/chicken/Hubei/R386/2012(H9)的核苷酸序列同源性最高(98.5%),HA裂解位点推导氨基酸序列为"-RSSR-",为典型低致病性AIV的特征序列,动物实验也显示该病毒株对鸡和小鼠呈现低致病性。本研究首次证实H9N2重组病毒株在我国鹌鹑中出现,为AI防控提供了实验依据。     

一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究

为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。     

Clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感疫苗候选株的构建

2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。     

一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2).为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点序列为341R-----346TRGLF350,为低致病性AIV特征.内部基因来源较复杂,与KD/CQ/036/12分离株的M基因NP基因同源性最高的病毒株均来自H4、H7等亚型分离株,呈明显的异源性.分离株的感染性试验显示,该分离株在鸡体内可以通过呼吸道和消化道向外排毒,但并不能在鸡体内有效的复制.对小鼠的感染性试验结果显示,仅在鼻甲和肺能检测到病毒存在,其他脏器病毒滴定结果为阴性,表明病毒对鸡和小鼠均呈低致病性.     

两株H1亚型禽流感病毒的全基因组序列测定及其对小鼠的感染性研究

为了解H1亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年从我国南方活禽市场分离到的两株鸭源H1亚型AIV A/duck/Hu N/S10153/2015(H1N1)(简称Hu N/153/15)和A/duck/JX/S11233/2015(H1N3)(简称JX/1233/15)进行全基因组序列的测定及进化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染性试验。氨基酸序列分析显示:两株病毒HA裂解位点均只含有一个碱性氨基酸,具有低致病性AIV(LPAIV)的分子特征,其中Hu N/153/15的内部基因片段来源复杂,呈现明显的遗传多样性。小鼠感染性试验结果显示,Hu N/153/15能够在小鼠的肺脏和鼻甲中有效复制,而JX/1233/15在小鼠的各个脏器中均未检测到病毒的复制,表明其暂时还不具备感染哺乳动物的能力。本研究结果为H1亚型AIV的持续性监测和相关生物学特性的研究奠定基础。     

一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒（AIV）的生物学特性分析

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为PLRESR↓GLF,属于低致病性AIV(LPAIV)。对其各基因节段分别经BLAST比对后发现,其外部基因来源于H5N6亚型AIV,内部基因完全来源于H9N2亚型AIV,推测该分离株为一株重组病毒。将CK/HeB/S1/19病毒株接种SPF鸡及BALB/c小鼠研究其致病性,结果显示,该病毒虽然能够感染鸡,但不能在鸡体内有效复制,而该病毒未经适应就可在3只小鼠的鼻甲和肺中进行复制,对小鼠呈低致病性。本研究为H5亚型AIV的检测和其感染的综合防控提供了参考依据。     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。     

H7N3亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为建立H7N3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)A/Duck/Zhejiang/690/2009(H7N3)(ZJ690)、A/Duck/Zhejiang/766/2009(H7N3)(ZJ766)反向遗传操作系统,本研究采用8质粒系统共转染293T细胞,成功拯救出了R-ZJ690和R-ZJ766 2株病毒。对获救病毒株进行全基因序列的测定,证实获救病毒的序列与亲本毒的序列完全一致。将H7N3亚型AIV亲本毒ZJ690株、ZJ766株和拯救病毒R-ZJ690株、R-ZJ766株均以106EID50剂量经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,病毒均引起小鼠的体重下降但不造成死亡,感染后d4,仅在小鼠的鼻和肺中可以分离到病毒。由此可见,R-ZJ690、R-ZJ766与其亲本毒ZJ690株、ZJ766株保持了一致的生物学特性。本研究成功建立了H7N3 AIV ZJ690、ZJ766株的反向遗传操作系统,为H7亚型AIV的致病机理和跨宿主传播机制研究等奠定了基础。     

一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV)，命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8)，简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性，本研究对其基因组测序并经遗传演化分析，结果显示，该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF，符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支，外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年～2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高，且处于同一分支；PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高，为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高，且处于同一分支，推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示，该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示，该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制，但其在A549中的复制效率高于其在MD...     

H9N2亚型禽流感病毒糖基化位点突变株的构建与生物学特性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。     

两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究

2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。