牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的研究

为了防控A型多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的牛纤维素性化脓性肺炎以及B型Pm引起的牛出血性败血症,本研究制备了牛Pm病二价灭活疫苗(A型Pm-TJ株+B型C45-2株),并将疫苗分别以0.3 m L和4 m L接种小鼠和兔后,所有接种动物均健活;分别以单剂量(2 m L)、单剂量重复、超剂量(4 m L)接种肉牛和奶牛后,接种牛均无不良反应,而且接种疫苗对肉牛增重和奶牛产奶量均无影响,表明疫苗安全性良好。以不同的免疫剂量接种牛后,分别采用A型和B型Pm强毒菌液对免疫牛进行攻击,结果显示,疫苗能够对攻毒牛产生良好的免疫保护,并且疫苗的免疫效力呈现剂量依赖性,最小免疫剂量为1 m L (对A、B型Pm攻毒牛的保护率分别达到75%与100%)。此外,犊牛接种疫苗10个月后攻毒,对A、B型菌攻毒牛的保护率仍分别能够达到75%与100%,表明该疫苗的免疫持续期至少可达10个月。综上所述,该牛Pm二价灭活疫苗能够有效预防牛纤维素性化脓性肺炎和牛出血性败血症,该疫苗的推广应用将对我国牛Pm病的防控发挥关键性作用。     

一株致病性血清2型猪链球菌的多位点序列分型及其灭活后对小鼠的免疫保护效果评价

为鉴定一株2012年分离自广东省的致病菌并评价其免疫原性,本研究对该分离株进行分型鉴定和MSLT分型分析。鉴定结果显示,该分离株为血清2型猪链球菌(S.suis);其MSLT分型为ST1型,等位基因图谱是1、1、1、1、1、1、1,与高致病性的世界流行株P1/7同型;毒力基因型为Mrp+/Ef+/Sly+,将其命名为GD。进一步使用GD灭活菌以3×108cfu剂量3次免疫小鼠,免疫后分别采用GD,7型、9型S.suis WH和ZD进行攻毒试验。动物试验结果显示,免疫后小鼠抗体水平显著升高;对GD、WH和ZD的保护率分别为87.5%、87.5%和75%;免疫组小鼠血液和脏器内的细菌载量均显著低于对照组,而且无明显病变。本研究结果表明,GD灭活疫苗可以对不同血清型S.suis攻毒提供有效的免疫保护,可以作为预防S.suis病的有效灭活疫苗候选株。     

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠的保护性研究

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌是导致牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease,BRD）的重要细菌性病原,每年给养牛业带来巨大的经济损失,目前对其疫苗研究仍显不足。本研究选用牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,Mh） Mh422株和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm） PmCQ2株作为疫苗菌株,分别制备了2种菌体浓度的Mh和Pm单价灭活菌苗及3种菌量配比（1∶1、2∶1和3∶1）的Mh-Pm二联灭活苗,以小鼠为模型,皮下多点免疫（0.2 mL）,加强免疫2次,免疫剂量均为首免的一半。首免后第7天及其后每隔5 d,小鼠尾静脉采血分离血清,ELISA方法检测抗体效价,三免后第20天,分别以Mh422或PmCQ2进行腹腔攻毒测定免疫保护效果。结果显示,所有小鼠接种疫苗均无不良反应,二免后第10天抗体达较高水平,三免后抗体水平持续升高,第15天到达高峰,其后25 d维持高水平,后缓慢下降。Mh单菌苗的2种免疫剂量对Mh422株攻毒的免疫保护率均为0,而Pm单菌苗的2种免疫剂量对PmCQ2株攻毒的免疫保护率全为100%;Mh和Pm间无交叉免疫保护作用;3种菌量配比的Mh-Pm二联疫苗对Mh422株和PmCQ2株攻毒的各自免疫保护率分别为53%～71%和100%。该研究结果表明,所制备的Mh422单菌苗对同型攻毒无免疫保护作用,在诱导机体抗体产生方面,Mh和Pm间无相互抑制作用,PmCQ2株具有促进Mh422株灭活疫苗对Mh422的免疫保护作用,这为牛溶血性曼氏杆菌和牛多杀性巴氏杆菌二联疫苗的进一步研究提供了理论基础。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌培养特性和免疫原性的研究

为了确定牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)的培养特性,本研究采用脑心浸液(BHI)培养基分别于静止、75r/min、250r/min3种培养转速对Pm进行培养,并与加血BHI进行比较,通过绘制生长曲线和小鼠毒力试验对Pm的培养基和培养转速条件进行优化,确定最佳培养条件为,以37℃,0.1%全血脑心浸汤(MB-HI)培养基,75r/min培养16h。将培养的A型Pm灭活后,免疫SPF小鼠,同时设立B型Pm灭活苗免疫组,攻A型Pm后的结果显示,A型灭活菌的保护率为100%,而B型灭活苗免疫组全部死亡。本研究通过对牛源A型Pm培养特性和免疫原性的研究,为新型牛出血性败血症灭活疫苗的研制提供了实验依据。     

牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的实验室制备及小鼠攻毒试验分析

从患病牛中分离的两株A型多杀性巴氏杆菌WC1654株和LD01株分别进行生化试验、PCR鉴定、LD50测定、细菌灭活、疫苗配置、小鼠免疫和攻毒保护试验。PCR结果显示,两株多杀性巴氏杆菌WC1654株和LD01株均含有5种毒力基因。攻毒试验结果灭活疫苗对免疫小鼠保护率为60%。为巴氏杆菌病高效疫苗的研究与开发奠定基础,为防治牛A型多杀性巴氏杆菌病提供一种生物制品。     

狂犬病灭活疫苗CVS-11株对牛的免疫效果

野生狐和貉狂犬病流行于新疆、内蒙古和黑龙江地区,是当地牛、羊和骆驼等家畜狂犬病的主要传染源。在国内尚无野生动物口服疫苗的前提下,对家畜进行狂犬病灭活疫苗接种,具有重要的公共卫生学意义。本研究利用国产犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)对牛进行了免疫效果和安全性评价。以不同剂量疫苗肌内注射免疫成年牛350头,通过比较免疫后狂犬病病毒中和抗体水平和持续期,确定犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)在牛的最佳免疫剂量为1次性注射2剂量疫苗,免疫持续期为1年。结果表明,犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)免疫牛时,具有较高的免疫原性和安全性,适用于牛等大型动物的狂犬病注射免疫。     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株，本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株，对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定，再将最小发病剂量定为攻毒剂量，进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示，11株分离株均具有较强的毒力，从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强，最小发病剂量分别约为2.0×10⁴、1.8×10³和2.3×10³CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性，不仅可以抵抗同源菌株的攻击，还能对同血清型异源菌株提供良好的保护，免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高，且与攻毒保护相关性较好，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10⁸、1.0×10<...     

血清10型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染是主要危害2~8周龄雏鸭的高致病性细菌性传染病。为研制血清10型RA灭活油乳剂疫苗,选取10株血清10型RA分离株进行动物体复壮、分离和鉴定后,分别对部分毒株进行了毒力测定和灭活油乳剂疫苗的研制。结果表明,所有试验用分离株对7日龄雏鸭均具有较强的致病力。分离株YXL1和HXb2的半数致死量分别为2.8×108 cfu和82 cfu,不同菌株之间的毒力差异很大。用研制的灭活油乳剂疫苗对雏鸭进行2次免疫后,免疫鸭可获得高水平的特异性抗体,并可抵抗强毒RA的攻击,以HXb2免疫后的攻毒保护性最好。抗体水平检测和攻毒保护试验结果表明,用血清10型RA分离株HXb2制备的油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护作用。     

牛源空肠弯曲杆菌及其HSP43重组蛋白免疫原性研究

为评价牛源空肠弯曲杆菌(C.jejuni)及其HSP43重组蛋白(rHSP43)的免疫原性,本研究采用常规方法分别制备白油、铝胶佐剂和不加佐剂的全菌体免疫原和rHSP43免疫原,分别以不同剂量经皮下接种途径免疫6周龄小鼠,应用间接ELISA方法检测两种免疫原免疫小鼠后抗体消长情况,并通过攻毒实验评价其保护效果。结果显示,其产生的抗体水平白油佐剂组要高于铝胶佐剂组,两者明显高于未加佐剂组(p0.05)。在全菌体免疫原组中,5×109cfu/mL组免疫保护率高于5×107cfu/mL组,前者与5×105cfu/mL组相比较差异极显著(p0.01)。在小鼠免疫后21d以1×1010剂量的C.jejuni攻菌,全菌体免疫原能够提供完全保护,而以白油佐剂乳化的rHSP43仅能提供75%的保护。本研究结果为C.jejuni的疫苗研制提供了实验依据。     

血清1型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制

为研究血清1型鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer,RA)的灭活油乳剂疫苗,本研究将10株血清1型RA的临床分离株经腿部肌肉注射7日龄雏鸭进行动物体内复壮,结果表明所有被测菌株均具有较强的毒力,易感雏鸭致死率100％.对其中3株RA分离株CH3、WJ4和YL4的毒力测定结果表明其半数致死量(LD50)分别为2×108 cfu、3.25×108 cfu和2.37×106 cfu.选取5株RA分离株分别制备灭活油乳剂疫苗,分别于5日龄和18日龄对樱桃谷鸭进行两次免疫后,免疫鸭能够产生高水平的RA特异性抗体,对2 LD50 WJ4或CH3攻毒产生很好的保护效果,其中由CH3、CQ3和YXb12制备的灭活油乳剂疫苗对攻毒的保护率高达100％.     

貂源伪狂犬病毒DL14/08株免疫原性及其保护效果的研究

为研制貂源伪狂犬病(PR)灭活疫苗,本实验室从疑似患PR的水貂脑组织中分离到一株PR病毒(PRV)DL14/08株(10~(7.10)TCID_(50)/m L),采用甲醛灭活以铝胶为佐剂制备了水貂源PR灭活疫苗。采用水貂和家兔对疫苗进行安全性检验和最小免疫剂量测定,结果显示水貂和家兔的最小免疫剂量均为5×10~(5.6)TCID_(50)/m L;采用研制的PR灭活疫苗和商品化猪用PR灭活疫苗免疫水貂,免疫21 d后平均中和抗体分别为1∶516和1∶348,用相当于100倍半数致死量毒力的分离株病毒攻毒,自制灭活疫苗组保护率为100%,商品化疫苗组保护率为80%。实验结果表明,制备的水貂源PR灭活疫苗抗体水平及攻毒后保护率明显高于商品化疫苗,能够有效保护强毒株对水貂的攻击,可以作为水貂伪PRV预防和控制的候选疫苗株。     

鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟的免疫效果初探

以0.5%的甲醛溶液为灭活剂,制备鳗弧菌灭活疫苗,经过无菌和安全试验后,按照2 m L/尾的剂量,通过腹腔注射途径注射浓度为1.78×108cfu/m L的鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟进行免疫;对照组用同等剂量生理盐水处理。免疫7 d后,对试验鱼进行鳗弧菌活菌攻毒。攻毒试验7 d后,计算疫苗的免疫保护率。结果表明,在实验室条件下,0.5%甲醛灭活的鳗弧菌疫苗对杂交鲟安全,免疫保护率为80%。     

牛支原体感染动物模型的建立及其在评估灭活疫苗免疫效力上的应用

为了找到能够成功模拟牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)感染的方便可行的替代动物,并为灭活疫苗的初步探索做出贡献,采用原代次、第80代次、第160代次的M.bovis,每代分别设1.0×109、1.0×1010和1.0×1011CFU/m L 3个浓度对健康家兔进行感染试验,通过临床表征、剖检观察、病理组织切片镜检、分离培养、PCR法进行验证,显示每个代次M.bovis均呈阳性,且浓度越高、代次越低,症状越明显。家兔可成功模拟M.bovis感染情况,并确定M.bovis在体外连续传代培养过程中毒力明显减弱但仍具有致病性,第160代次M.bovis可作为疫苗备选株;将160代次M.bovis灭活后与铝胶盐佐剂1∶1混合制成灭活疫苗对家兔进行免疫试验,在第1次免疫后第14天进行第2次免疫,在第28天时对免疫组和空白对照组家兔进行攻毒试验,结果显示免疫组家兔经血清抗体法检测出体内具有较高水平的抗体,且经上述方法检测免疫组结果均呈阴性,空白对照组检测结果均呈阳性。结果表明:弱毒的M.bovis灭活疫苗也能够起到免疫防御的作用,为M.bovis疫苗回归本动物试验的研究提供了有力的数据支撑。     

猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗免疫抗体水平分析

为评估猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗的免疫原性,用商品化的乙型脑炎鼠脑疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗(SA14-14-2株)以及自制乙型脑炎细胞灭活疫苗(HW1株)分别免疫仔猪,通过抗体水平监测试验、中和抗体试验、小鼠攻毒保护试验分别检测了其特异性抗体消长情况、中和抗体效价产生情况及疫苗对小鼠的攻毒保护率。结果显示,3种疫苗均能产生中和抗体,乙型脑炎细胞灭活疫苗免疫组中和抗体水平要高于鼠脑疫苗和弱毒疫苗免疫组,乙型脑炎细胞灭活疫苗和弱毒疫苗免疫组对小鼠的攻毒保护率高于鼠脑疫苗免疫组,但两者之间差异不显著。抗体消长情况显示,至8周观测期结束,鼠脑疫苗免疫组的抗体阳性率为80%,乙型脑炎细胞灭活疫苗和弱毒疫苗免疫组抗体阳性率为100%。结果表明猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗的免疫原性优于鼠脑灭活疫苗和弱毒疫苗。     

羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明小鼠的致病性研究

为研究羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明系(KM)小鼠的致病性,使用羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株分别对昆明小鼠进行毒力测定,观察临床和剖检症状,对死亡小鼠进行细菌分离培养,并对典型菌落进行形态、生化特性以及PCR鉴定。毒力测定结果显示CVCC55001对于昆明小鼠的最小致死剂量为9 CFU,CVCC55002对于昆明小鼠的最小致死剂量为11 CFU。感染羊链球菌死亡小鼠主要剖检症状为肝脏出血、肠道液化性坏死、脾脏肿大,病理变化为肝细胞出现大量坏死、肠道黏膜层广泛自溶、脾脏组织广泛坏死出血。本研究建立了羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,确定了最小致死剂量,对羊链球菌感染和致病性研究展开初步探索,为疫苗研究及评价提供了平台支撑。     

评价牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力BALB/c鼠模型的建立

为建立评价流产布鲁氏菌疫苗株免疫保护力的小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,随机分为3组(n=40):A19免疫攻毒组、非免疫攻毒组和PBS对照组。A19免疫组腹腔接种BALB/c鼠A19 5.0×10⁴ CFU,非免疫攻毒组和PBS对照组均接种PBS液0.2 mL。免疫后45 d,A19免疫攻毒组和非免疫攻毒组BALB/c鼠以3.0×10⁴ CFU剂量的2308强毒株攻击,攻毒后15和45 d分别剖杀小鼠,取小鼠脾脏称重、细菌分离、病理组织学检测。结果表明,攻毒后15 d,A19免疫攻毒组与未免疫攻毒组和PBS对照组之间克脾指数差异显著(P<0.05);攻毒后45 d,A19免疫攻毒组与PBS对照组的克脾指数差异不显著(P>0.05),与未免疫攻毒组克脾指数差异显著(P<0.05);免疫攻毒组的小鼠组织病理变化明显轻于未免疫攻毒组。结果表明,用BALB/c鼠为试验动物,以A19为疫苗参考株建立动物实验模型可以应用于牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力评价。     

含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究

为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,血清RHDV HI效价为1∶16～1∶64,攻毒后免疫兔均健活(5/5);免疫后21 d,用Pm和Cp分别攻毒,免疫兔80%以上(4/5～5/5)保护;免疫持续期可达210 d。RHDV VP60蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗,解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题,同时实现了一针三防。     

新城疫病毒样颗粒(ND-VLPs)免疫效力的研究

为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化.2周后用相同剂量的VLPs加强免疫.二免后2周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒.攻毒前,La Sota灭活苗、La Sota 20μg VLP和不同剂量VLPs组(10 μg、20 μg、25 μg)HI效价分别为28.3、28.9、24.1、26.1、26.7;攻毒后,10 μg和20 μg VLP免疫组仅能提供了80%和90%的保护率,但与La Sota灭活苗、La Sota 20 μg VLP一样,25 μg VLP试验组却能够完全抵抗致死剂量的NDV强毒攻击.本试验表明,ND-VLPs具有良好的免疫原性,25 μg VLP诱导机体产生的免疫应答能抵抗致死剂量强毒的攻击.ND-VLPs有可能用来研制针对新城疫流行变异株的高效疫苗.