猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

猪伪狂犬病毒Bartha株与变异株疫苗免疫后中和效价比较试验

通当前由于伪狂犬病毒变异株在全国流行,引起人们对疫苗选择的关注,产生是否换用疫苗的不同看法。为了给生产提供疫苗选择的参考,本研究选用某进口猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha株疫苗和某国产PRV变异株疫苗,分别免疫15头仔猪,经2次免疫后第3周采血清,检测血清中和效价,并对结果进行统计分析。结果显示,变异株疫苗免疫后中和效价明显高于该进口Bartha株疫苗。     

猪伪狂犬病病毒变异株在国内的研究进展

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的猪病毒性传染病。免疫接种疫苗是防控伪狂犬病的有效途径之一,但是近年来在我国很多地区的伪狂犬病疫苗免疫猪群中接连暴发了新的伪狂犬病疫情,主要原因是由于伪狂犬病病毒发生了新的变异,新的PRV流行变异株与传统的PRV相比抗原性已发生较大变化。本文从PRV的特征、PRV变异株流行情况、PRV变异株主要毒力蛋白及其遗传变异、PRV变异株疫苗的研制及PRV感染的防控等方面进行阐述,旨在为PRV流行变异株的防控提供参考。     

猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高(99.5%~100%),而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。     

猪伪狂犬病变异株及其疫苗的研究进展

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引发的高致死率的一种急性传染病。PRV变异株的出现使得PR在全国范围内广泛流传,其发病特征和致病性也变得十分严重,并且现有疫苗起不到完全的保护作用。本文对PRV变异株的致病性、分子特征和分子基础及PRV变异株疫苗研制等方面的研究进展进行了综述,以期为PRV的防控和净化提供新思路。     

一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

本研究运用同源重组的方法,在伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株PRV JS-2012基础上,构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒,命名为r PRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析,结果表明重组病毒构建成功,并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示,r PRV JS-2012-EGFP与亲本株PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将r PRV JS-2012-EGFP毒接种14日龄PRV阴性仔猪,能使实验猪100%发病,病死率高达40%,表明r PRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株,在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。     

一例猪繁殖与呼吸综合征醮实验室诊断

2011年10月,四川邛崃某猪场发生了一种以经产母猪流产、死产、产木乃伊胎、死胎及弱仔为主要特征的疾病。为确定病原,剖解2头病死仔猪,采集肺脏、脾脏组织,混合研磨提取组织总RNA,以实验室建立猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）核酸检测方法进行这2种病原的RT-PCR检测;采集小脑组织以酚氯仿法提取组织总DNA,进行伪狂犬病毒（PRV）PCR检测。结果显示CSFV与PRV均为阴性,PRRSV变异株和经典株均为阳性。诊断为猪蓝耳病变异株与经典株混合感染。     

猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究

将猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）基础毒种F7传至F13，并将PRV F8～PRV F13六个代次毒种接种仔猪进行安全性检验，PRV F8、PRV F10、PRV F13三个代次毒种接种仔猪进行免疫原性检验，用以研究猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性。安全性检验结果显示，各代次毒种经颈部肌肉接种仔猪，观察期内仔猪精神、食欲、体温均正常；免疫原性检验结果显示，免疫组仔猪攻毒后精神、食欲、体温均正常，对照组仔猪攻毒后体温升高，全部发病并死亡。以上结果表明，猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）不同代次的生产毒种对仔猪均安全且保持良好的免疫原性。     

猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28～35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28～35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178～1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28～35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。     

猪伪狂犬病病毒变异株GD株的分离鉴定及TK和gE基因的进化分析

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行变异毒株的病原学特性及分子遗传变异特点,本研究从广东省某疑似暴发猪伪狂犬病的猪场采集的病料中分离到一株PRV毒株,命名为GD株。该病毒在PK-15细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,病毒滴度可达109.0 TCID50/mL。将病毒感染KM SPF小鼠,接种小鼠在4 d内全部死亡,并且均出现典型的PR症状。序列比对结果显示,PRV GD株的TK和gE基因与国内外PRV参考株的核苷酸同源性分别为99.4%～100%和97.6～99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%～100%和95.5%～99.8%。基于gE基因的遗传进化分析发现,PRV GD株与国内近几年分离鉴定的流行变异毒株位于同一分支上。与经典株相比,PRV GD株的gE蛋白氨基酸序列在48和496位均有1个天冬氨酸(D)的插入,符合PRV变异株的典型特征。本研究成功分离到一株PRV变异株,为PRV流行变异毒株的防控和新型疫苗的研究提供一定的科学依据。     

猪伪狂犬病病毒HP-SY2022株的分离鉴定

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究对沈阳某养殖场疑似感染PRV的组织病料进行PCR鉴定、病毒分离和纯化、gD、gE基因序列测定及分析、动物回归实验。结果显示：分离株能在ST细胞中产生典型的细胞病变,且PCR显示为PRV阳性;通过gD、gE基因进行序列分析发现,分离株与2011年后分离的PRV变异株位于同一进化分支;氨基酸位点分析发现分离株与PRV变异株具有相同的变异模式。进一步研究其致病性,将纯化后的病毒液接种PRV抗体阴性21日龄健康仔猪,感染仔猪出现典型的PR症状,如呼吸困难、转圈、流涎和划水动作,且在试验期内仔猪全部发病(5/5),其中4头死亡(4/5)。综上,本研究成功分离到一株PRV变异株,将其命名为HP-SY2022。这一研究为丰富我国PRV分子流行病学及后续的免疫防控提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究

本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。     

猪伪狂犬病病毒基因结构及功能研究进展

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)为疱疹病毒科DNA病毒,可引起仔猪高热、神经症状和母猪繁殖障碍。PRV由于其传播途径多样、危害大的特点,给我国猪业养殖带造成了巨大损失。PRV的基因是其发挥生物学功能的基础,自2011年以来我国PRV不断出现变异,国外进口疫苗已不能起到很好的保护作用,这对PRV的防控形成了不小的挑战。论文对PRV的基因结构及主要基因功能进行了归纳总结,为PRV新疫苗及药物的研发提供理论参考。     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的多重PCR诊断临床应用研究

为了研究规模猪场病毒性疾病早期、快速诊断方法,试验采用多重PCR方法对来自宁夏灵武地区某种猪场的临床血清进行了猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)的病原诊断。结果表明:在哺乳仔猪、保育猪、母猪及种公猪中均检测出PRV、PCV-2阳性个体,PCV-2的阳性率达87.5%,PRV的阳性率为12.5%,但未检测出PPV。临床样品主要为PCV-2和PRV混合感染,阳性率达45.3%,其中1头主要采精的长白种猪携带有PCV-2和PRV。因此,推断该场仔猪发病可能与种公猪的带毒有关,建议该场仔猪全群免疫,同时对感染与带毒种猪群进行净化。     

2015－2020年天津地区猪伪狂犬病病毒gB、gC、gE基因遗传变异分析

为掌握天津地区猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）的流行及遗传变异情况,本研究对2015－2020年天津地区分离的20个分离株的gB、gC和gE基因进行扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。相似性分析结果显示,分离株与2012年后中国变异株相比,3种基因核苷酸及编码氨基酸序列相似性分别为：gB基因均为99.9%~100%;gC基因为99.7%~100%和99.4%~100%;gE基因为99.7%~100%和99.6%~100%。遗传进化和序列比对分析结果显示,依据gB、gC、gE基因绘制遗传进化树均可将PRV毒株分为GⅠ型和GⅡ型,天津分离株属于GⅡ型;其中19个分离株与PRV变异株遗传关系较近,属于同一亚分支,并存在相同的氨基酸变异位点;另外1个分离株（TJBD6株）gB和gE基因与PRV变异株遗传关系较近,氨基酸变异位置与PRV变异株一致,但其gC基因与经典株Ea株遗传关系较近,且核苷酸和氨基酸序列相似性为100%。上述结果表明,2015年以来天津地区流行的PRV毒株存在经典株和变异株2种类型,其中变异株为主要流行株。本次研究初步调查了天津地区PRV分子流行特征,可为猪伪狂犬病防控提供依据。     

猪伪狂犬病毒变异株(Fujian-LY)对免疫仔猪的致病性研究

本实验室2014年从福建省龙岩市某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒变异株,命名为PRV Fujian-LY株。为了研究Fujian-LY株对免疫仔猪的致病性,将8头20龄的PRV抗原、gE抗体均为阴性,gB抗体均为阳性仔猪随机分为3组,其中2组(每组3头猪)分别通过肌肉注射和滴鼻接种Fujian-LY株,第3组2头仔猪做阴性对照。试验仔猪接种病毒24h后体温均开始升高,随着病程发展,呼吸系统症状明显,滴鼻接种组仔猪发病明显快于肌肉注射组,所有攻毒仔猪虽均有发病但未出现死亡。通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养、易感动物感染试验及gE抗体ELISA检测证实Fujian-LY株人工攻毒试验成功。gE抗体检测结果表明所有攻毒仔猪攻毒后7dPRV gE抗体开始阳转。对发病仔猪剖检可见,脑积液明显增多,脑膜血管充血,并伴有出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片观察结果显示发病仔猪脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围"血管套"现象,其他主要脏器也均有明显的病理变化。试验结果表明PRV Fujian-LY株为伪狂犬病毒强毒株。     

山东省某规模猪场猪伪狂犬病毒变异毒株的分离与鉴定

2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201和ZJ01株序列同源性为99.4%～99.8%,且位于同一遗传进化分支。选择70日龄PRV阴性健康猪接种PRV-YT株,发病率和死亡率均达100%(5/5),均表现严重脑组织、肝脏与肺脏损伤,表明PRV-YT株为猪伪狂犬病病毒变异强毒株。本研究为制定猪伪狂犬病防控方案提供了重要基础。     

伪狂犬病病毒TK、gE双基因缺失传代致弱株的安全性及免疫效力研究

为获得安全、有效的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株弱毒疫苗，在前期研究的基础上，对PRV变异株TK、gE双基因缺失株(PRV LA1206株)进行传代致弱，在鸡胚成纤维细胞上连续传代75次，后经连续5代挑取单个病毒蚀斑克隆而得F₈₀代，毒种命名为PRV LA1206-80株，并对其进行安全性及免疫效力评价。生长动力学试验结果显示，PRV LA1206-80株与PRV LA1206株生长动力学相似。仔猪安全性试验结果显示，滴鼻接种1日龄PRV抗体阴性仔猪后所有仔猪均未出现发热及临床症状，表明该毒株对1日龄仔猪安全。攻毒保护试验结果显示，28～35日龄仔猪肌肉注射接种PRV LA1206-80株或PRV LA1206株7 d后进行变异株PRV AH02LA株滴鼻攻毒，可产生良好保护，所有仔猪均未出现体温反应、临床症状和排毒。而PRV Bartha K61株免疫猪7 d后攻毒，均出现了体温反应，其中1头发病，且鼻拭子样品均检出病毒。综上所述，相较于PRV LA1206株，在鸡胚成纤维细胞上连续传代后获得的PRV LA1206-80株已...     

2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析

为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013-2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示：样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。