牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

牦牛Smad4基因mRNA组织表达谱及其miRNAs初步研究

本研究旨在了解牦牛Smad4基因mRNA组织表达谱,并探索研究可能靶定Smad4基因的miRNAs。利用RT-PCR技术对牦牛Smad4基因的mRNA在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫12种组织中的表达谱进行分析,并运用TargentScan和miRBase软件预测可能靶定牛Smad4基因的miRNAs,并分析其在牦牛上的组织表达谱。结果表明,Smad4基因mRNA在所检测的牦牛12种组织中均有表达,尤其是在生殖系统的卵巢、输卵管、子宫组织中广泛表达;预测到可能靶定牦牛Smad4基因的miRNA共20个,从中选择6个进行表达谱分析发现,bta-miR-106a和bta-miR-377在所检测的12种组织中均有表达,bta-miR-146a、bta-miR-224和bta-miR-1434-5p除了在输卵管中没有表达外,在其他组织均有表达,bta-miR-212只在卵巢中有表达。综上表明,Smad4基因在牦牛各组织中可能发挥重要作用,bta-miR-212可能仅在卵巢组织作用于靶定Smad4基因,并参与牦牛繁殖生理过程调控,其机制有待进一步研究证实。     

BMP15通过bta-miR-2285bc-BMPR2调控牛卵泡颗粒细胞功能的研究

本实验旨在探究牛卵泡颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）bta-miR-2285bc与BMPR2的靶标关系，及其作为BMP15下游关键因子对GCs增殖和卵泡发育的潜在调控作用。利用miRanda预测bta-miR-2285bc与BMPR2 3’UTR的结合位点，构建BMPR2 3’UTR野生型与突变型双荧光报告载体，并通过双荧光素酶报告试验验证其靶标关系；屠宰场获取牛卵巢并于实验室分离直径4～8 mm卵泡，刮取卵泡壁GCs进行体外培养。设置浓度梯度，根据BMPR2表达量确定BMP15最适添加浓度。转染bta-miR-2285bc mimics/inhibitor至GCs并添加BMP15,qRT-PCR和Western blotting分别检测BMPR2 mRNA和蛋白表达，随后qRT-PCR检测GCs BMP/Smad信号通路、增殖、凋亡和类固醇激素合成相关基因表达水平，Elisa检测细胞培养液中雌激素（E2）和孕激素（P4）浓度。结果显示：bta-miR-2285bc能够靶向结合BMPR2 3’UTR；向体外培养的GCs添加最适浓度BMP15(100ng/mL)并转染b...     

肉牛DKK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒构建及与miR-25的靶向验证

实验旨在鉴定miR-25与肉牛DKK3基因之间的靶向关系，为开展miR-25调控肉牛肌内脂肪生成的分子机制研究奠定基础。利用生物信息学分析软件TargetScan预测miR-25的潜在靶基因及结合位点，然后PCR扩增包含miR-25结合位点的肉牛DKK3基因3’非编码区（3’UTR）片段，构建DKK33’UTR野生型、突变型及删除型双荧光素酶报告基因质粒，并分别与miR-25 mimics和mimics NC共转染牛肾细胞（MDBK），检测双荧光素酶活性；此外，miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC分别转染MDBK细胞，荧光定量PCR和Western blot检测DKK3表达量。结果表明：TargetScan软件预测到miR-25具有包括DKK3在内的共944个潜在靶基因，且与DKK3结合的靶位点位于DKK3基因3’UTR的25～32 bp处；构建的3种质粒经双酶切后释放出大小约321 bp的条带，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功；miR-25mimics可显著降低DKK3野生型质粒的双荧光素酶活性；过表达miR-...     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

兔microRNA-18b生物信息学分析及其与CDK19的靶向验证

为探究miR-18b对兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及潜在调控靶点,利用生物信息学技术预测兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能参与的生物学过程。预测结果发现靶基因的功能注释分析显著富集在细胞增殖和凋亡的调控等过程,而其中CDK19可能是miR-18b的潜在靶基因。为验证假设,将扩增的野生型及突变型的CDK19 3'UTR序列分别克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-18b的mimics(试验组)或mimics NC(对照组)共同转染至HEK293T细胞。通过双荧光素酶报告系统检测细胞的荧光素酶活性,鉴定miR-18b与CDK19 3'UTR的靶向关系。并且通过qRT-PCR检测miR-18b对靶基因的调控作用。结果表明:成功构建了CDK19基因3'UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其荧光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b与CDK19表达模式相反。从而证明了miR-18b与CDK19的直接靶向关系,为更深入研究miR-18b与卵巢颗粒细胞的关系奠定基础。     

调控牛CEBPA基因表达的miRNA筛选及对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

旨在筛选并验证调控牛增强子结合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)表达的miRNA及其对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。本研究综合运用多个在线软件筛选与CEBPA基因具有潜在调控关系的miRNA,运用qRT-PCR技术检测CEBPA基因在关岭牛各类组织中的表达水平;构建CEBPA-3′UTR-WT和CEBPA-3′UTR-MUT双荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告系统验证候选miRNA与CEBPA基因的结合关系;分离培养关岭牛肌内前体脂肪细胞,利用qRT-PCR、Western blot、油红O染色和CCK-8探究调控CEBPA的miRNA对牛肌内前体脂肪细胞分化与增殖的影响。生物信息学分析发现,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d与CEBPA基因具有潜在结合关系;qRT-PCR结果表明,CEBPA基因在关岭牛内脏组织、肌肉组织、脂肪、下丘脑以及部分生殖器官中均有表达,在2岁牛背最长肌的表达量极显著高于1日龄犊牛(P0.01);双荧光素酶报告系统结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接结合牛CEBPA基因3′UTR;细胞试验结果表明,CEBPA基因在牛肌内前体脂肪细胞分化中的表达水平随时间逐渐升高,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化0 d表达水平极显著高于其他时期(P0.01),整个分化时期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a与CEBPA基因表达趋势相反;过表达miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能极显著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表达量(P0.01),并降低牛肌内前体脂肪细胞中脂滴含量;bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性促进细胞增殖。结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性的促进牛肌内前体脂肪细胞增殖,并通过直接负调控CEBPA的表达来间接影响该细胞分化。     

猪microRNA-206新靶基因G6PD的鉴定及表达模式分析

利用生物信息学软件Targetscan预测miR-206的靶基因,并获得6个与肌纤维类型相关的候选靶基因。分析miR-206与其中一个候选靶基因G6PD的结合位点及最小自由能,将miR-206与G6PD野生型和突变型G6PD双荧光素酶报告载体共转染至293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统证实miR-206与G6PD的靶标关系;采用qRT-PCR分别检测miR-206和G6PD在猪不同组织、不同肌纤维类型的肌肉以及高低组肌内脂肪含量样品中的表达水平。结果显示,猪miR-206与G6PD的3′UTR存在3个结合位点;双荧光素酶报告基因系统分析结果显示,过表达miR-206能显著降低野生型G6PD质粒的荧光活性,共转染miR-206后,突变质粒M1、M2、M4的双荧光素酶活性显著高于野生型G6PD质粒(P0.05),而突变质粒M3与野生型G6PD质粒无显著差异(P0.05);猪miR-206在骨骼肌组织中特异性表达,且在快肌中表达量显著高于慢肌(P0.05)。G6PD在脂肪组织中的表达普遍高于其他组织,除心肌外,G6PD在骨骼肌中的表达量最低,但其在快肌和慢肌中的表达量无显著差异(P 0.05)。miR-206和G6PD在高低组肌内脂肪含量样品的表达量均无显著差异(P0.05)。结果表明,猪miR-206通过前2个结合位点靶向调控G6PD,但G6PD不能影响猪骨骼肌肌纤维类型的转化与肌内脂肪沉积,其功能以及miR-206调控肌纤维的机制仍需进一步探究。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

β-miR-33a特异调控HADHB基因3′UTR靶标位点验证

为验证β-miR-33a与候选基因HADHB3′UTR是否存在特异性识别的靶标关系,本试验将β-miR-33amimics、β-miR-33ainhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过Real-time(qPCR)验证β-miR-33a与HADHB基因mRNA水平表达量的关系。利用PCR获得奶牛HADHB3′UTR 201bp DNA片段,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中,获得野生型载体,利用定点突变技术将HADHB3′UTR种子区-CAATGCA定点突变-CATGTAGC,获得突变型载体。将野生型载体和突变型载体分别与β-miR-33a-mimics组成双荧光素酶报告系统,转染至奶牛乳腺上皮细胞,48h后测定其荧光活性。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞中转染的野生型与突变型载体的双荧光活性存在显著性差异(P<0.05),由此证明,在奶牛乳腺上皮细胞中β-miR-33a可以与HADHB3′UTR的靶位点-CAATGCA特异性结合。     

miR-141-3P和miR-346在对靶基因FSHR的识别与验证

为探索miRNA-141-3P和miRNA-346在大鼠腺垂体中的靶基因,并对其进行识别与验证。本研究利用PCR方法,根据Fshr(Rattus)3′UTR野生型载体序列信息设计突变引物将靶序列CAGTGTT(78-85)突变为GTCACAA和GGCAGAC(127-133)突变为CCGTCTG,以野生型载体为模板PCR扩增Fshr基因的3′UTR突变序列,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中。由于miRNA是通过3′UTR区作用于靶基因,因此将miRNA与构建好的报告基因载体共转,通过报告基因相对荧光值的下调来印证miRNA与靶基因的相互作用。双荧光素酶报告基因表达分析显示,rno-miR-141-3p mimic对Fshr野生型载体的报告荧光没有明显下调作用;rnomiR-346mimic对Fshr野生型载体的报告荧光有明显下调作用,相应结合位点突变后,突变型载体中的报告荧光与野生型相比有所恢复;rno-miR-141-3p mimic和rno-miR-346mimic同时处理,对野生型载体的报告荧光有一定的下调作用。在体外,rno-miR-141-3p可能不能通过Fshr上相应的3UTR位点调控报告基因的表达;rno-miR-346有可能通过Fshr上相应的3′UTR位点调控报告基因的表达。本试验为FSHR的转录后调控研究提供了理论依据。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

miR-R-203在鸡成肌细胞中靶向抑制EIFEIF4E基因表达的研究

为了进一步研究和探索mi R-203在鸡骨骼肌发育中的作用,本研究通过对mi R-203进行靶标预测,发现真核起始因子4E(EIF4E)基因的3′UTR区存在mi R-203的潜在靶标位点。通过构建连接有EIF4E 3′UTR和靶位点突变的EIF4E 3′UTR-MUT的双荧光素酶靶标验证载体,将其分别转染到已过表达mi R-203或阴性对照鸡的DF-1细胞中,检测其中的荧光素酶活性。结果显示,mi R-203能显著抑制EIF4E 3′UTR载体的荧光素酶活性,但不影响EIF4E 3′UTR-MUT载体的荧光素酶活性,mi R-203能靶向调控鸡EIF4E的表达,研究结果为深入分析miR-203在鸡骨骼肌中的功能和作用机制奠定基础。