猪群中7种高发传染病多重PCR诊断方法的建立

[目的]建立猪瘟、蓝耳病(又称猪繁殖与呼吸综合征)、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染7种猪病的多重PCR诊断方法.[方法]根据GenBank发表的核苷酸序列设计了分别针对猪瘟、蓝耳病、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染的2套多重PCR特异性引物,优化多重PCR反应条件后进行敏感性与特异性评价.[结果]建立的2套多重PCR诊断方法对其他常见猪病痛原的基因组无特异性扩增,检测病原基因组最低浓度可达到pg级.[结论]该研究建立的2套多重PCR诊断方法可以用于猪群中上述7种猪病痛原的单一感染或混合感染的鉴别诊断.     

浅谈猪病检测中多重PCR技术的运用

多重PCR技术具体指的是一种分子诊断技术,通过该技术的应用可以在同一个反应体系中在同一时间内进行多个目的片段的扩增,具备有特异,敏感,快捷等众多优势,非常适合在大量的临床样本中展开快速检测.本文讲述了多重PCR技术的一些技术原理,以及进猪病检测中多重PCR技术的具体应用进行了分析.     

多引物PCR法检测蚕卵的微粒子病的新方法

我们用多个PCR引物的混合物来评估多引物PCR法在早期诊断和多种微孢子虫同时感染家蚕的检测是否确实有效。当感染蚕微粒子病的蚕卵的DNA被提取出来做DNA模板时,用多引物PCR扩增某些特殊的DNA序列。     

多重荧光定量PCR在动物检测中的应用

多重荧光定量PCR技术可以利用一次反应,同时检测、鉴别出多种病原体,在临床混合感染的诊断上具有独特优势和很高的实用价值。与实时荧光定量PCR技术结合,可以定量拷贝数、省去PCR后处理,减少交叉污染,整个检测过程耗时短、准确、高效、特异。因此本文对多重荧光定量PCR技术的分类及各种方法的优缺点做了简要概述,并对近年来多重荧光定量PCR在动物中的应用概况及其研究进展,如在动物性食品卫生中的应用、细菌病诊断、病毒病诊断、饲料中动物源性成分的检测、抗性基因检测及肿瘤早期诊断等有关方面进行概述,旨在为该技术的进一步开发应用提供理论参考。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

应用三重聚合酶链反应同时检测NDV、IBV、MG的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV和MG三种病原体的三重PCR技术。根据NDV、IBV和MG的基因文库,设计了三对分别与测NDV、IBV和MG某段基因序互补的引物,用这三对引物对同一样品中的测NDV、IBV、MG核酸模进行多重PCR扩增。结果均同时得到了三条特异性大小与实验设计相符的310bp（NDV）、1720bp(IBV)和732bp(MG)多重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,多重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和1pg的MG DNA模板。     

GeXP多重基因表达分析系统研究进展

Genome Lab Ge XP(Gene e Xpression Profiler)是由美国Beckman Coulter公司推出一个多基因分析平台。该系统采用荧光标记的通用引物和末端连接有通用引物序列的特异性嵌合引物相结合引发多重体系扩增,解决了由于PCR选择和PCR漂移引起的传统多重PCR技术的扩增偏爱性,并与毛细管电泳相结合,解决了琼脂糖凝胶电泳因分辨率不高造成的假阴性和假阳性。本文主要介绍了Ge XP多重基因表达分析系统的技术背景、基本原理、扩增优势,重点阐述了其在各方面的应用现状及发展趋势。     

多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术在微生物检测中具有快速、灵敏、操作简单等优点,而多重PCR检测还可以同时扩增多个目的基因,对高效快速检测具有重要意义,已经成为近几年来的研究热点。作者对近来多重PCR技术在食品病原微生物、食品非致病微生物及相关环境食品微生物中应用的研究现状,以及未来在食品检测中的应用展望进行了综述。     

多重PCR方法快速检测3种消化道病原菌

为建立一种检测和鉴别诊断动物奇异变形杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌感染的方法,本研究针对奇异变形杆菌脲酶调节子基因(ureR)、沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)及产气荚膜梭菌α毒素基因(α-toxin)序列设计引物,建立一种同时检测3种细菌的多重PCR方法,并对扩增体系和条件进行了优化,建立的多重PCR检测方法特异性良好,对3种目的菌最低检出限均在105cfu/mL以上。初步应用该方法检测3种细菌单独人工感染小鼠的病变组织和人工模拟细菌混合感染的临床样品,结果证明该方法可以用于临床样本检测。     

PCR方法鉴定牛早期胚胎性别研究进展

对用于早期胚胎性别鉴定的多重PCR、巢式PCR、引物一扩展预扩增PCR、非电泳PCR和LAMP法等扩增技术进行了综述,并针对早期胚胎性别鉴定技术在养牛业生产中的应用现状和存在问题进行分析与讨论,展望了PCR性别鉴定技术在养牛业中广阔的商业应用前景。     

羔羊痢疾病原体的分离与PCR鉴定

羔羊痢疾是由B型产气荚膜梭菌引起的新生羔羊的一种急性毒血症,临床以严重腹泻、脱水,剖检以小肠形成溃疡灶为主要症状。本试验从疑似病料中分离到病原体,通过病原体的实验室诊断和PCR鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌。本试验的研究为羔羊痢疾病快速诊断、流行病学研究提供了科学依据,为建立多重PCR诊断方法奠定了基础。     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析。结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定。巢式PCR,公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24)。SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物。     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

牛布鲁菌病奶液PCR检测方法的建立及初步应用

为探讨以牛奶为材料检测牛布鲁菌感染的可行性,本试验建立了可鉴定布鲁菌属的单重PCR以及可鉴定布鲁菌种的多重PCR.结果显示,单重PCR方法的特异性强,只特异性的扩增布鲁菌DNA,对照菌株大肠杆菌、牛败血性波氏杆菌、根瘤农杆菌和苍白杆菌的扩增结果均为阴性;奶液中细菌检测灵敏度为1.08×104CFU/mL.用建立的多重PCR对7株不同种的布鲁菌体和基因组进行鉴定,表明该方法可以区分不同种布鲁菌.本试验中建立的PCR方法能够鉴定所有致病性布鲁菌并对疫苗株和野生毒株加以区分,适用于实验室布鲁菌的快速鉴定.     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

牛早期胚胎性别快速鉴别的研究

根据聚合酶链式反应中聚合酶的扩增特性,对PCR反应的循环参数进行研究,取消了PCR反应中延伸这1温度梯度,对2温度梯度PCR方法进行了单重PCR和多重PCR扩增研究,并采用2温度梯度多重PCR方法分别对牛基因组、成纤维细胞、胚胎样品进行了性别鉴别研究,建立了稳定、简便、快速的用于牛早期胚胎性别鉴别的2温度梯度PCR方法.同时还对2温度梯度PCR的扩增能力进行了研究,结果表明：2温度梯度PCR方法能够扩增片段的可能长度为633 bp.     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体(MG)、滑液囊霉形体(MS)、衣阿华霉形体(MI)和火鸡霉形体(MM)的基因文库，设计了4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物，用这4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果，均同时得到了4条特异性的大小与试验设计相符的732bp(MG)、207bp(MS)、299bp(MI)、850bp(MM)多重PCR扩增带，而对其他6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，此多重PCR能同时检出1pg的MG、MS、MI和MM DNA模板。     

7种猪场常见高致死病原GeXP检测方法的建立

本研究旨在建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、坏死梭杆菌(Fn)和副猪嗜血杆菌(Hps)7种猪场常见高致死性流行病原的多重PCR检测方法。利用7种病原体的保守序列设计7对特异性引物,同时合成了Cy-5标记的通用引物。将通用引物分别连接到特异性引物的5′端形成7对特异性嵌合引物。优化反应条件,分别使用7组嵌合引物和通用引物混合,扩增7种病原的混合cDNA/DNA,验证其单重PCR的特异性。利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,混合7种嵌合引物和通用引物,扩增单一病原的cDNA/DNA,验证其多重PCR特异性;将其他常见猪病病原的基因组作为干扰的阳性标本,利用7对混合嵌合引物和通用引物进行多重PCR分析,扩增加入了阳性标本的混合模板,验证其多重PCR的抗干扰能力。利用重组质粒和体外转录的RNA进行梯度稀释,确定GeXP多重检测体系的灵敏度。结果表明,7种不同引物分别进行GeXP单重及多重检测,均能检测出特异性目的片段的信号,无明显的干扰片段信号出现;GeXP多重检测抗干扰试验结果显示,在混入3种干扰病原模板后,依然可同时特异性检测出7种病原;GeXP多重检测灵敏度分析显示,在10~3拷贝/μL浓度条件下能检测到7种不同基因的特异性结果。本研究建立的同时检测7种猪场常见高致死性流行病原的GeXP检测方法具有高通量、高特异性和高灵敏度的特点,为快速诊断猪流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的检测方法。     

多重PCR反应的影响因素及其优化

多重PCR是近年来兴起的一项技术,它高效、快捷、高度特异、敏感,已经成为诸多实验室的常规诊断技术。由于多重PCR实验设计比单一PCR更为复杂,使得不同研究获得的优化程序不具有通用性,因而大大降低了多重PCR的适用性,限制了多重PCR的运用范围。文章就多重PCR的影响因素及其优化条件进行了综述,以期为研究和应用多重PCR技术提供理论参考。