狂犬病病毒检测方法的研究进展

狂犬病病毒(RV)属弹状病毒科、狂犬病病毒属,病毒呈杆状,一端扁平,另一端钝圆,长180～250 nm,宽75 nm,基因组为12 kb的单股负链RNA,从3′端至5′端依次为N、NS、M、G、L 五个结构基因,分别编码五种结构蛋白,即核蛋白(N)、磷酸化蛋白(NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G) 和转录酶蛋白(L).     

狂犬病毒河南分离株G基因的克隆与生物信息学分析

狂犬病(狂犬病)是由狂犬病病毒引起的在全球范围内广泛传播的人兽共患病,一旦感染死亡率几乎为100%.RV属于弹状病毒科,狂犬病毒属,其基因组为单股负链RNA病毒,基因组大小约为12kb,基因组从3'-5'方向有5个结构基因,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L).其中G蛋白可以结合细胞受体并与细胞融合,同时G蛋白为病毒中和抗体(Virus Neutralization antibody,VNA)的靶蛋白,可以提供抵抗病毒的完全保护力.因此,以G蛋白为研究对象对于狂犬病的防控有重要意义.     

狂犬病病毒磷蛋白的相关研究概况

狂犬病病毒（RV）属于弹状病毒科狂犬病毒属。基因组为不分节段负股RNA,编码5种结构蛋白：核蛋白（N）,磷蛋白（P）,基质蛋白（M）,糖蛋白（G）和大蛋白（L）。病毒RNA聚合酶由L和P蛋白组成,L蛋白是主要的催化组分,P蛋白是非催化的辅助因子[1,2]。病毒RNA由相连的N蛋白、P蛋白和L蛋白紧紧包裹形成典型的螺旋状核糖核蛋白（RNP）复合物,可激活RNA合成。     

展示狂犬病病毒保护性抗原的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2为基础,以8202株狂犬病病毒基因组为模板,通过PCR扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因(8202-G″)。通过MluⅠ和EcoRⅠ双酶切pPolyⅡ-CAV-2质粒,获得含有Ⅸ蛋白的340bp片段,将其克隆入pEGFP-C1-dAseⅠ质粒中,构建pEGFP-SIX载体,该载体经AseⅠ单酶切插入8202-G″,即在编码Ⅸ蛋白基因的最后密码子与终止密码子之间按与Ⅸ蛋白编码链相同转录方向插入8202-G″基因,获得重组基因组质粒和pPolyII-CAV-2-ⅨG(34.8kb)。酶切鉴定结果显示,目的基因均克隆进Ⅸ蛋白中。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了1对PCR引物，以伪狂犬病病毒Ea株(pseudorabies virus Ea，PRv Ea)基因组DNA为模板．扩增出一大小为511bp的片段。通过酶切和测序证实，该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因，即gL基因。Blast软件分析表明，该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为94％，氨基酸序列的同源性为95％。将测序结果输入GenBank，获得登录号AF448456。     

狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达

采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。     

狂犬病病毒野毒株糖蛋白基因序列测定及分析比较

对我国河南某地野鼠体内分离的狂犬病病毒野毒株MRV糖蛋白全基因进行序列测定，与已发表的代表性毒株糖蛋白基因进行核苷酸和推导氨基酸序列的比较分析，结果表明在同一基因型中，MRV和国际标准攻毒株CVS的同源性最高(96．5％)，和中国减毒株CTN的同源性最低(79．8％)；在G基因的四个功能区中，氨基酸同源性最高的是抗原区，同源性最低的是膜内区；MRV的抗原部位和糖基化位点氨基酸均有变异；建立了各毒株的系统进化树。     

鸡新城疫病毒分离株WF00C HN基因的测序与序列分析

新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)是一种禽类传染病的病原,属副黏病毒科禽腮腺炎病毒属.该病毒是具有囊膜、单股、负链、不分节段的RNA病毒, 由15 186或15 192个核苷酸组成.基因组包含6个基因,分别编码3′-NP-P-M-F-HN-L-5′六个主要多肽(即NP核蛋白、P磷蛋白、M基质蛋白、F融合蛋白、HN血凝素-神经氨酸酶和L聚合酶).     

狂犬病病毒糖蛋白功能的研究进展

狂犬病是一种危害极大的人兽共患病.该病流行于世界80多个国家和地区,近年来发病率有所升高[1],严重威胁人畜健康.狂犬病病毒(RV)属弹状病毒科狂犬病病毒属.狂犬病病毒基因组是由11 928个或11 932个核苷酸组成的单股负链不分节段的RNA,相对分子质量约4.6 ×106.基因组从3'端至5'端的排列依次为核蛋白基...     

狂犬病毒GSQY-Dog-China-2013株全基因组序列测定和遗传进化分析

为了全面分析我国狂犬病病毒遗传进化情况，本试验使用反转录PCR(RT-PCR)方法将狂犬病病毒GSQY-Dog-China-2013分为10个片段进行扩增，回收目的片段并与pMD20-T simple载体连接，转化JM109感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序；使用DNASTAR软件中的Edit Seq通过拼接相邻片段之间的重叠序列获得GSQY-Dog-China-2013全基因组序列，构建系统进化树进行遗传进化分析。结果显示，GSQY-Dog-China-2013全长11 924核苷酸(nt),包含5个开放阅读框，分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L);基于全基因组序列的进化树分析显示，GSQY-Dog-China-2013株和国内分离株形成一个分支，在国内分离株中与SXYL15株和SXBJ15株形成一个分支，亲缘关系最接近，提示GSQY-Dog-China-2013可能源自我国陕西省。本试验系甘肃省首次报道狂犬病病毒全基因组序列，进一步丰富了我国狂犬病病毒遗传进化数据，为狂犬病全面防治以及疫苗研发提供了数据支持。     

狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区真核表达载体的构建及其在DK细胞中的表达

为了研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)糖蛋白(rgp)膜外区在以糖蛋白为免疫原的免疫应答中的作用,提取RV的RNA,通过RT-PCR扩增RV糖蛋白膜外区1375 bp的序列,将其克隆入pMD18-T载体中,经测序比对正确后,通过酶切将其亚克隆入pVAX1表达载体的多克隆酶切位点处,将酶切鉴定正确的阳性重组子命名为pVAX-rgp,构建表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的真核表达载体,在质脂体介导下转染DK细胞观察其表达情况。研究结果表明,经免疫荧光和Western blotting鉴定,有特异性荧光和60 ku条带产生,证明pVAX-rgp载体中的rgp可在DK细胞中表达。本研究通过成功构建狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区的真核表达载体,为下一步有关功能基因组的研究和基因疫苗的研制奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

伪狂犬病病毒gⅢ基因的克隆及其鉴定

以质粒ｐＵＣ１８和ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）为载体，克隆了伪狂犬病病毒Ｓ株基因组ＤＮＡ的ＰｓｔⅠ酶切４．３ｋｂ片段，该片段含有完整的ｐｒｖ４３基因和ｇⅢ糖蛋白基因。经酶切分析和对转化菌融合蛋白的免疫反应性及免疫原性分析，鉴定了重组质粒ｐＵＣ４．３和ｐＧｅ４．３，从而证实其插入片段含有完整的ｇⅢ糖蛋白基因。     

狂犬病病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒穿梭载体的构建及表达

提取HEP-Flury株狂犬病病毒RNA,RT-PCR方法扩增糖蛋白G基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序鉴定和序列分析。之后双酶切下G基因,将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,经卡那霉素抗性、PCR、双酶切及测序鉴定,获得重组单G腺病毒穿梭载体pShuttle-G。应用PCR方法在G基因末端引入口蹄疫病毒2A自剪切肽序列,并克隆入T载体,同时构建含G基因的T载体,分别双酶切回收以上2片段并将他们定向亚克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1,经系列鉴定,成功构建由2A自剪切肽序列连接双G基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dG。转染以上2个表达质粒入Ad-293细胞,荧光显微镜观察到GFP的表达,斑点印迹试验结果显示G蛋白成功表达。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒（RV）糖蛋白抗原，采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因，将其克隆于pMD18-T载体，再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因，将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）、pET-32a（＋）和pGEX-4T-1中，经PCR和双酶切鉴定以及序列分析，表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）中进行表达，结果显示，克隆到pET-32a（＋）的糖蛋白膜外区基因表达量最高，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测，不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应，表明，重组蛋白具有良好的反应原性。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

狂犬病病毒糖蛋白基因正向重组伪狂犬病病毒（疫苗株TK^-／gI^-）的构建

构建以伪狂犬病病毒(PRV)为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组活载体疫苗。采用AseⅠ/MluⅠ切下EG-FP-rgp的表达盒,将其克隆入p8-AA载体的酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8-EGFP/rgp。将该质粒与PRV TK-/gI-基因组在质脂体介导下共转染PK-15细胞,获得PRV-EGFP/rgp重组病毒;通过噬斑克隆对其进行筛选、纯化,并通过RT-PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光对其进行鉴定,并对重组病毒的滴度、外源基因的遗传稳定性及其与亲本病毒株生长特性的关系进行了测定。结果表明:重组病毒的滴度(TCID50)为108.125/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;PRV-EGFP/rgp与亲本病毒PRV TK-/gI-生长趋势差异不显著。通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组PRV的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制提供了新的思路和方法。     

狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体的制备

用狂犬病病毒BD06株脑毒免疫BALB/c小鼠,制备G蛋白单克隆抗体。将灭活的BD06脑毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA法和荧光抗体病毒中和试验法进行4轮筛选,获得6F12、1B12共2株具有中和活性的糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blotting分析和直接免疫荧光检测结果显示,获得一株针对狂犬病病毒糖蛋白构象表位的单抗6F12和一株针对糖蛋白线性表位的单抗1B12。小鼠中和试验结果显示,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均具有狂犬病病毒中和活性。结果表明,获得了两株针对狂犬病病毒G蛋白不同抗原表位的中和活性单克隆抗体,为狂犬病病毒特性研究和检测奠定了基础。     

肌注狂犬病病毒糖蛋白cDNA表达载体诱导的小鼠体液免疫反应

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段分别正向插入ｐｍＭＴ－１ＢｇｌⅡ位点和ｐＭＴ０１０／Ａ＋ＢａｍＨＩ位点，构建重组质粒ｐｍＭＴ－Ｒｇｐ和ｐＭＴ０１０／Ａ＋－Ｒｇｐ，通过磷酸钙共沉淀法转染ＢＨＫ－２１细胞，经ＰＣＲ、打点杂交及ＥＬＩＳＡ检测，证明糖蛋白基因发生了整合并获得表达。以该表达载体给小鼠肌肉内注射２～３次，采其注射前、后双份血清，经ＥＬＩＳＡ检测证明，注射了表达载体的小鼠，血清中病毒特异性抗体明显升高，表明狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ在小鼠体内表达后，刺激机体产生了抗该糖蛋白特异性抗体     

狂犬病病毒分子流行病学研究进展

介绍了狂犬病病毒的流行特点、基因型和检测方法 ,综述了狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因的研究进展 ,并简要概述了我国学者对狂犬病病毒N基因和G基因的序列分析比较结果 ,表明我国狂犬病病毒的街毒存在着地域差异。