猪胸膜肺炎放线杆菌APX I A蛋白的截断表达与鉴定

溶血外毒素（Apx）是胸膜肺炎放线杆菌（APP）最主要的毒力因子及保护性抗原。利用PCR技术扩增APP血清5型编码APXIN一端具有保护性抗原表位的APXIA部分基因,扩增片段长度为1149bp。将其插入原核表达载体PET-32a中,转化至E．coilBL21中诱导表达。SDSPAGE分析结果表明APXIA基因能在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白的分子量约为40ku。Western-blot结果表明该融合蛋白能被APP阳性猪血清所识别,指示表达的蛋白具有良好的免疫活性,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊治及高效亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素抗原优势决定簇的筛选和融合表达

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法，本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ～Ⅲ)生物学信息分析的基础上，以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ～Ⅲ分段扩增后进行截短表达，获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析，确定ApxⅠ～Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列，无缝克隆3个蛋白片段基因，通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合，具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立

APXⅣA基因是新发现的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的RTX毒素基因,本文通过PCR方法从APP标准血清1型及临床分离到的3株野毒株中扩增出长为442 bp的部分APXⅣA基因,而从其它引起猪呼吸道疾病的细菌中无法扩增出此片段.通过玻板凝集试验鉴定这三株野毒株为血清1型APP.所建立的PCR方法能检测的DNA量最高敏感度为28pg.表明本文所建立的对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性.     

胸膜肺炎放线杆菌ApxlA毒素蛋白免疫原性分析

为鉴定胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)ApxIA毒素蛋白N端疏水区和C端Ca~(2 )结合区的免疫原性,参照apxIA基因序列(D16582)设计4条引物,用于扩增APP血清10型参考菌株(D13039)基因组DNA中长约3.2kb的apxIA基因及其N端(1.4kb)和C端(1.8kb)基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体DET-32a中进行表达,表达的融合蛋白大小分别约为125Ku、65Ku和80Ku。表达产物免疫小鼠后的攻毒保护试验结果显示,ApxIA表达蛋白对APP血清10型(D13039)攻毒可提供完全保护,而对APP血清1型(4074)攻毒仅能提供部分保护,与提纯的ApxⅠ毒素蛋白免疫保护效果相当;ApxIA-N端表达蛋白免疫保护活性显著高于ApxIA-C端表达蛋白,提示ApxIA蛋白免疫活性位点多位于N端,在ApxⅠ毒素蛋白的保护性抗原活性中发挥更重要作用     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠；设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1149 bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41 ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELIS...     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。     

胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1／apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA／apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1．2％;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15．4％。利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1／apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA／apxⅠA分别进行表达。结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32％;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白。证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型的DNA提取物中扩增出大小为2873bp的APXⅡA基因片段；将PCR产物重组到质粒载体pMD18-T中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株M30602的同源性达99．7％。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA毒素蛋白免疫原性分析

为鉴定胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）ApxIA毒素蛋白N端疏水区和C端Ca^2＋结合区的免疫原性，参照apxIA基因序列（D16582）设计4条引物，用于扩增APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中长约3．2kb的apxIA基因及其N端（1．4kb）和C端（1．8kb）基因片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，表达的融合蛋白大小分别约为125Ku、65Ku和80Ku。表达产物免疫小鼠后的攻毒保护试验结果显示，ApxIA表达蛋白对APP血清10型（D13039）攻毒可提供完全保护，而对APP血清1型（4074）攻毒仅能提供部分保护，与提纯的Apx1毒素蛋白免疫保护效果相当；ApxIA-N端表达蛋白免疫保护活性显著高于ApxIA-C端表达蛋白，提示ApxIA蛋白免疫活性位点多位于N端，在Apx1毒素蛋白的保护性抗原活性中发挥更重要作用。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25—4株为研究对象，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序，并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E．coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在，包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western—blotting免疫印迹实验，结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。     

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立

根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL ISA检测方法奠定了基础     

丝状支原体丝状亚种SC型LppC基因的表达纯化

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PGI的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100％,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白。Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。     

胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种呼吸道传染性疾病.根据荚膜多糖和脂多糖抗原表位不同,将胸膜肺炎放线杆菌分为15个血清型,不同血清型的菌株毒力大小不同,致病性也有强弱之别.研究发现与APP致病性有关的毒力因子包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、溶血外毒素等,其中溶血外毒素是APP引起猪致病最主要的毒力因子,也是主要的保护性抗原.论文从猪传染性胸膜肺炎溶血外毒素的分子结构、致病机制、免疫原性几个方面对其进行综述,为获得以Apx为抗原制备减毒活疫苗提供参考资料.     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

猪传染性胸膜肺炎的PCR快速诊断及基因组酶切分析

为了建立猪胸膜肺炎放线杆菌(Actionbacillus pleuropneumoniae,APP)快速PCR诊断方法,试验依据APP的毒素基因Apx ⅣA的序列设计引物,对江西农业大学动物科学技术学院预防兽医学教研组保存的4个血清型APP菌株以及大肠埃希杆菌、沙门杆菌进行PCR扩增,同时对提取的4个血清型菌株的基因组DNA用EcoRⅠ酶切。结果表明:4个APP菌株均成功扩增出预期大小的基因片段,而其他G-菌没有扩增出;4个血清型菌株的基因组DNA经EcoRⅠ酶切后酶切片段有所不同。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型蛋白的表达研究

为了研究金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型的检测方法,诱导融合表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ型蛋白,试验根据Gen Bank中SEⅠ的序列设计一对特异性引物,采用PCR技术从金黄色葡萄球菌中扩增出新型肠毒素Ⅰ型基因,亚克隆入p EASY-E1载体中,构建重组质粒p EASY-E1-SEⅠ,以IPTG诱导表达,镍柱纯化表达蛋白,用His标签单克隆抗体进行免疫印迹分析验证融合蛋白的表达。结果表明:成功扩增出SEⅠ基因,片段大小为507 bp,重组质粒高效表达SEⅠ融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定成功表达了分子质量约为26 ku的重组蛋白,Western-blot检测表明目的蛋白具有良好的免疫原性。说明表达系统p EASY-E1/BL21能高效表达金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ蛋白。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅲ A基因的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

应用PCR方法扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinabacillus pleuropneumoniae,App)编码毒素A结构蛋白的完整基因,连接到载体pMD18-T中,经Not和Snab双酶切后连接到用同样酶切的表达载体pPIC9k上,转化GS115酵母感受态细胞,经甲醇诱导表达了分泌到胞外的Apx A蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为110 000,与预期相符。Dot-blot和ELISA检测结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。为进一步研究Apx A蛋白的结构和功能,研制App重组诊断抗原或亚单位疫苗奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌整合膜蛋白基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的保护性免疫机制,试验采用筛选APP3～8kb随机基因组文库的方法获得1株阳性克隆,经测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为APP整合膜蛋白(IM)基因,预计成熟蛋白分子质量为48.431ku。根据序列设计特异性引物并PCR扩增该基因,分子克隆表达该整合膜蛋白。Western-blot分析表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应,说明该蛋白在免疫应答中起作用。     

A型禽偏肺病毒F蛋白的原核表达与抗原性分析

利用大肠杆菌表达A型禽偏肺病毒(aMPV)F融合蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增aMPV F融合蛋白的编码基因,与原核表达载体pBCX(pet43.1改造载体)连接构建重组表达载体pBCX/aMPV/A/F,从上清中非变性纯化重组蛋白,并进行Western-blotting分析。结果表明,该融合蛋白相对分子质量为74 kDa,具有与aMPV单克隆抗体良好的结合能力,说明此融合蛋白具有良好的抗原性,可用于抗体检测。