我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异

采用 RT-PCR方法 ,从我国 1 0个省、市、自治区收集的 2 3个猪瘟病毒 ( CSFV)流行毒株中 ,扩增了CSFV E2基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定 ,通过计算机分析构建了系统发生树 ,并确定了它们间的遗传相关性。结果表明 ,2 3个流行毒株中的 1 8株属基因 群 ,占 78.2 6%;另外 5个流行株与传统石门强毒、兔化弱毒株属基因 群 ,占 2 1 .74 %。两群间测序区的核酸同源性只有 78.90 %。此外 ,根据序列差异程度 ,将基因 群流行株分为 3个亚群 ,各基因群 CSFV在地域分布上未发现有明显的特征性。本研究初步揭示了我国较大范围内流行的 CSFV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异 ,以及我国猪瘟病毒流行株在地域分布上的多样性     

猪瘟病毒基因2型流行毒株和疫苗C株抗血清与相应E2蛋白交叉免疫反应性分析

为研究猪瘟病毒(CSFV)2.1基因亚型病毒株和疫苗C株E2蛋白与相应抗血清的免疫反应性差异,本研究在分析4株CSFV浙江流行株(QZ-14、JH-14、QZ-07和HZ-08)与疫苗C株E2变异程度的基础上,制备了流行病毒株和疫苗C株全病毒猪抗血清以及针对流行株E2的单克隆抗体(MAb)4F4,比较了它们与同源株和异源株重组杆状病毒表达的E2蛋白的亲和性。结果显示,4株浙江分离株中2株(QZ-14和JH-14)属于亚型2.1d,另2株(QZ-07和HZ-08)为亚型2.1b,它们与C株E2的核苷酸同源性在82%~84%;间接免疫荧光鉴定显示MAb 4F4能够识别4株流行株,但不与C株反应;接种流行株的动物均出现不同程度临床症状;ELISA分析显示疫苗C株血清与流行株E2蛋白的反应性约为C株E2蛋白的27%~49%,2株流行株感染血清与C株E2蛋白反应性约为流行株E2蛋白的34%~50%,免疫印迹分析显示类似结果。以上结果表明CSFV基因2型流行株与疫苗C株E2蛋白的差异显著影响其与相应抗血清的交叉免疫反应性,这一现象是否与C株猪瘟疫苗免疫保护效果下降有关还有待于进一步研究。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。     

采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法对猪瘟强毒与疫苗弱毒的鉴别研究

为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法,本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物,其Tm值分别为84.5±0.5℃和88.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰.检测结果显示本实验建立的鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法特异性强,对其他相关病毒无特异性扩增;敏感性高,最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝;重复性好;并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测,为有效防制猪瘟提供依据.     

几株新城疫病毒毒株特性的测定

目前国内外应用的新城疫疫苗株以及各地分离的野毒株在抗原结构上无法区别,然而,不同的毒株在禽类中造成的流行病学、病状和病变都有较大的差异。一般可分为三个类型:即强毒型、中毒型和弱毒型。强毒型常突然爆发,迅速传播,导致大批死亡;中毒型也可使易感鸡群造成较大的损失;弱毒型仅对雏鸡有轻度反应但无死亡,     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。     

犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5，亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型，轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段，经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55，通过合成一系列重叠多肽，经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为²¹QQHSTRSTET³⁰。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示，CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带；IFA结果显示，感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明，该株MAb既能够与原核表达的CDV...     

A组猪轮状病毒NSP3蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP3的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究将原核表达、纯化的重组NSP3蛋白(r NSP3)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA法筛选,得到一株能够稳定分泌抗Po RV(G9)的杂交瘤细胞株(5B8)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型;MAb细胞培养上清液效价为1∶103,western blot及间接免疫荧光结果表明该株MAb能够与Po RV反应。对NSP3蛋白进行截短表达,采用western blot试验确定所获得的MAb识别的抗原表位区域序列为290QDYD RTFL297。该MAb的制备为进一步研究NSP3蛋白的结构和功能奠定了良好的基础。     

不同猪繁殖与呼吸综合征减毒活疫苗在猪体内的动态学及临床免疫效果比较

为了比较国内不同猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)弱毒疫苗的安全性和有效性,本研究将17头PRRSV抗原和抗体双阴性的28日龄仔猪随机分为4组,TJM-F92株弱毒疫苗组,JXA1-R株弱毒疫苗组,经典株弱毒疫苗(VR2332来源)组和注射生理盐水对照组。免疫后7,14,21,28d分别采血,ELISA抗体检测试剂盒检测PRRSV抗体,结果从免疫后14d起PRRSV抗体开始转阳,但各试验组的抗体水平无明显差异。对免疫后14d所采血样进行病毒分离,TJM-F92株免疫组未分离到PRRSV疫苗毒,JXA1-R株免疫组2头猪分离到PRRSV疫苗毒,经典株免疫组只1头猪分离到PRRSV疫苗毒。免疫后28d,所有猪接种PRRSV强毒株TJ株进行攻毒试验,观察各组猪的体温、临床症状;攻毒后21d,所有猪安乐死,剖检观察肺部病理变化。结果显示,TJM-F92株和JXA1-R株免疫组均未出现临床发病猪,经典株免疫组2头猪出现临床发病,对照组全部临床发病,死亡1头。经典株免疫组临床发病猪出现典型PRRSV感染肺部病理变化,而TJM-F92株和JXA1-R株免疫组均未发现典型PRRSV感染肺部病理变化。本研究证实TJM-F92株和JXA1-R株对高致病性PRRSV的免疫效果优于经典株弱毒疫苗,TJM-F92疫苗株与JXA1-R疫苗株相比,疫苗毒在体内带毒时间更短,安全性更高。