东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

红三叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验设计,对影响红三叶ISSR-PCR反应较大的4个因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4个水平上进行筛选,建立并优化了适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25μL反应体系中各反应物的最适含量为40ng模板DNA,10×PCR-buffer 2.5μL,2.5 mmol/L Mg2+,2.5UTaq DNA聚合酶,引物1μmol/L,0.2mmol/L dNTP。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,引物退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

鸭茅SRAP反应体系的建立与优化

为了为鸭茅分子标记辅助育种提供理论依据,研究采用L16(45)正交试验设计,对相关序列扩增多态性(SRAP)-PCR反应体系中的4种主要参数(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物)进行了分析。结果表明:建立的鸭茅SRAP-PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、引物0.4μmol/L,总体积为25μL。最佳PCR循环条件为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。     

山羊基因组DNA RAMP-PCR反应体系的建立

以山羊基因组DNA为材料,研究了MgCl2浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量对RAMP-PCR反应的影响.建立了一套适合山羊的最佳RAMP反应体系.反应总体积为25μL,MgCl2浓度2.0 mmol/L、引物为0.4 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、模板DNA为25 ng,TaqDNA聚合酶为1U.PCR反应程序为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,40℃ 45s,72℃ 90s,30 Cycles;72℃ 10 min.     

荷斯坦奶牛随机扩增多态DNA(RAPD)反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为试验材料,研究了Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2 浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合物浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

三角紫叶酢浆草ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计直观分析法,对影响三角紫叶酢浆草ISSR-PCR反应较大的5个因素(Mg²⁺、Taq酶、引物、模板DNA、dNTP)在5个水平上进行优化实验;从100个随机引物中筛选出适宜的引物,并筛选出其最佳退火温度;最后对反应程序进行优化。由此首次建立了适合三角紫叶酢浆草的ISSR-PCR反应体系:25 μL反应液中含10×buffer 2.5 μL,Mg²⁺ 1.25 mmol/L,Taq酶0.9 U,引物0.3 μmol/L,模板DNA 60～100 ng,dNTP 0.25 mmol/L。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,退火时间60 s(根据不同引物选择对应最佳退火温度),72℃延伸1.5 min,循环40次;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究酢浆草属植物提供理论依据和技术参考。     

仔猪腹泻源大肠杆菌耐药性调查及耐药基因检测

对泰州地区分离的仔猪腹泻源大肠杆菌的耐药性及其携带的相关耐药基因情况进行检测,为养殖场今后合理用药提供科学依据。采用微量肉汤稀释法对分离的49株大肠杆菌进行8种抗菌药物的药敏试验;采用PCR方法对多黏菌素耐药基因mcr-1及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM进行检测。药敏试验结果显示:大肠杆菌对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、庆大霉素和恩诺沙星等的耐药率分别达到100%、97.96%、95.92%、89.80%、59.18%和51.02%;而对多黏菌素E和头孢噻呋的耐药率也达到44.90%和32.65%。进一步耐药基因检测结果显示:ESBL耐药基因中blaCTX-M的检出率最高,达到12.24%(6/49);其次为blaSHV,8.16%(4/49);有一株大肠杆菌携带blaTEM基因。其中一株同时携带blaCTX-M和blaSHV。多黏菌素耐药基因mcr-1的检出率达到30.61%(15/49),其中4株同时携带blaCTX-M基因。泰州地区分离大肠杆菌耐药情况和多重耐药现象较为严重,多黏菌素耐药基因mcr-1及ESBL耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM的广泛分布表明这些耐药基因存在快速传播的风险。因此,有必要加强猪场细菌耐药性监测。     

猪源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的耐药性调查与耐药基因型分析

为了解猪源产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs)大肠杆菌的耐药基因型分布情况,采用CLSI推荐方法进行ESBLs表型检测和确证试验,采用PCR方法ESBLs耐药基因型分析。结果表明,60.21%(112/186)的猪源大肠杆菌菌株为ESBLs阳性。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和blaOXA型ESBLs菌株检出率分别为91.07%、68.75%、4.46%和1.78%。由此可见,河南部分猪场大肠杆菌广泛流行ESBLs,流行的主要基因型为blaCTX-M型和blaCTX-M+blaTEM型,且多为复合基因型耐药菌株。     

苜蓿基因组DNA提取和RAPD反应条件优选

采用CTAB法、N2-SDS法、SDS法和改进的CTAB法,提取苜蓿基因组DNA,比较其分离效果.结果表明,改进的CTAB法为最佳提取法.对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合苜蓿RAPD分析应用的体系组成为:反应液总体积25μL,14ng/μL模板DNA,2.5μL10x反应缓冲液,10碱基引物浓度0.1μmol/L,TaqDNA聚合酶1U,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg²⁺浓度2.5mmol/L.PCR反应循环为:94℃4min,36℃30s,2℃1min;94℃30s,36℃30s,2℃1min,45个循环;2℃延伸10min.     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

燕麦ISSR反应体系的建立与优化

以10个燕麦品种的基因组DNA为模板,从退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物5个方面对ISSR分子标记体系进行摸索并设计优化试验,建立了一套燕麦ISSR优化反应体系,即:25μl反应体系中,18.3μlddH2O,2.5μl 10×buffer,2.0μmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,1.5 U Taq DNA聚合酶,0.3μmol/L引物,10ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。     

早熟禾ISSR反应体系的优化

以早熟禾基因组DNA为模板.利用正交设计,对影响ISSR反应体系的主要因素(Mg2+、dNTP、Taq酶)从4个水平上进行筛选和优化,建立了适合早熟禾的最佳ISSR反应体系:25μl反应体系中1.25U Taq酶、1.5mmol/L Mg2+,10×PCR Buffer 2.5μl、0.4 mmol/L dNTP、1μl引物、1μl DNA模板.扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,56.4℃退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存.在此反应体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的条带.     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以内蒙古呼和浩特市近郊野生马蔺DNA为模板,采用均匀设计,通过5因素5水平和5因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度等)进行优化筛选,建立了适合马蔺的最佳ISSR-PCR反映体系:在25μl反应体系中,包括2.5μl 10×PCR Buffer、2.0mmol/L Mg2+、2.5μmol/L dNTP、1μmol/L引物1、.5U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA。在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性3min;然后进行40个循环(94℃变性45s,52.3～60.5℃退火30s,72℃延伸1.5 min);循环结束后,72℃延伸5min。     

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2 和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选.结果确定了星星草ISSR PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存.20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2 2.0mmol/L.     

鸡源大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析研究

为调查哈尔滨市周边地区鸡源大肠杆菌中超光谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型的流行情况,探索携带ESBLs对鸡源大肠杆菌耐药性的影响,从哈尔滨市周边地区多个养殖场分离了137株鸡源大肠杆菌,用微量肉汤稀释法测定137株菌对18种抗菌药物的最小抑菌浓度,采用CLSI推荐的表型筛选和确证试验检测大肠杆菌携带ESBLs情况,用PCR方法检测ESBLs基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaOXA)的流行分布情况。结果显示:109株大肠杆菌为产ESBLs菌株,占79.6%;137株鸡源大肠杆菌对临床常用18种抗菌药物产生不同程度耐药,且产ESBLs大肠杆菌的耐药性比非产ESBLs大肠杆菌的耐药性严重;blaTEM、blaCTX-M基因阳性率分别为40.9%、71.5%,所有菌株均未扩增出blaSHV和blaOXA基因。提示,blaTEM和blaCTX-M基因为哈尔滨地区鸡源产ESBLs大肠杆菌的流行基因型,且鸡源产ESBLs大肠杆菌菌株分布广泛,应加强当地用药监管。     

小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

为建立适宜小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）SSR PCR的反应体系,利用正交试验设计L16(45),对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立最佳反应体系和扩增程序。即在25 μL反应体系中包括：40 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTP,0.6 μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶,1×Buffer。扩增反应程序为：94℃10 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃;94℃ 45 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。应用该优化体系对小叶锦鸡儿种质资源及不同引物进行了检验及筛选。本研究表明,该体系的建立为今后利用SSR标记对小叶锦鸡儿属遗传多样性研究、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究工作提供依据。     

多花胡枝子基因组DNA提取与RAPD反应体系优化

以多花胡枝子干种子、萌发种子及开花期叶片三种材料提取基因组DNA,其中开花期叶片用CTAB法提取、干种子和萌发种子用SDS法提取的DNA均用于RAPD研究。结果表明,叶片基因组DNA的RAPD扩增最佳反应体系是:DNA模板用量为75ng,Mg²⁺浓度2.1mmol/L,dNTP浓度200μmol/L,随机引物浓度为0.2pm/μL,10×buffer2.5uL,TaqDNA聚合酶1.5个单位,反应总体积25uL;扩增反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s,36℃退火30s,72℃延伸1min,循环45次,72℃延伸10min。     

应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),以Bm NPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(Gen Bank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染Bm NPV(广西宜州分离株)2 h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测Bm NPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10×PCR buffer 1.5μL,5 mmol/L Mg Cl22μL,2.5mmol/L d NTP 0.5μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL,18 ng/μL模板DNA 1μL,加水至总体积15μL。确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环。按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100%。与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5 h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2 h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断。