猪圆环病毒2型ORF2基因的定点突变及其真核表达载体的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计并合成引物,采用重叠延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)定点诱变技术对ORF2基因进行定点突变。DNA测序结果表明,ORF2基因片段的372—378 bp处的碱基由TCTAGAT突变为ATTGGAT,从而破坏酶切位点XbaⅠ,成功获得ORF2的突变基因片段。进而将其连接到腺病毒真核表达载体pAD5-Blue中,成功构建真核表达载体,并获得PCV2的Cap蛋白表达产物,为PCV2新型疫苗研究奠定了重要基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的定点突变及其真核表达载体的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计并合成引物,采用重叠延伸PCR（splice overlap extension PCR,SOE-PCR）定点诱变技术对ORF2基因进行定点突变。DNA测序结果表明,ORF2基因片段的372—378 bp处的碱基由TCTAGAT突变为ATTGGAT,从而破坏酶切位点XbaⅠ,成功获得ORF2的突变基因片段。进而将其连接到腺病毒真核表达载体pAD5-Blue中,成功构建真核表达载体,并获得PCV2的Cap蛋白表达产物,为PCV2新型疫苗研究奠定了重要基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达

参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。     

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD.序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%～100%.用Nco Ⅰ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序.用Sac Ⅱ酶切pTS-PCV2-CD-C.回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C.PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCVl阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒.试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因.     

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达

猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由ORF2编码。采用PCR技术扩增得到ORF2基因片段,克隆入p UCm-T载体,构建了重组质粒p UCm-PCV2-ORF2。根据p UCm-PCV2-ORF2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体p GEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-ORF2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-ORF2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的GST-PCV2-ORF2重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF1、ORF2和ORF3原核表达和多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的核苷酸序列，设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了0RF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中，筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB—ORF2。对质粒中的插入片段测序后，应用DNAStar序列分析软件，对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果，3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100％；它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高，达99．5％。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒1型ORF2基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

獭兔睾丸的组织学观察

家兔作为一种实验动物 ,推动了繁殖技术的发展。本试验通过对不同年龄公獭兔的睾丸进行组织学观察、测定 ,研究精子的发生规律 ,为系统地进行繁殖生理工作提供依据。1　材料与方法选 60日龄、75日龄、90日龄 3个年龄公獭兔各5只 ,用外科手术法摘取两侧睾丸 ,放入 Bouin氏液中固定 ,二甲苯透明 ,石蜡包埋 ,切成 5～ 8μm切片 ,H.E.染色。在显微镜下观察 ,并进行定量组织学指标测定及差异性比较。2　结果和讨论2 .1　睾丸定量组织学指标的测定结果　见表 1。表 1　獭兔睾丸定量组织学指标　　　μm,个 /精细管60日龄 75日龄 90日龄曲细精管…     

Observations of fracture of the anconeal process of the ulna of swine

Fractures of the anconeal process of 5 pigs ranging in age from 4 to 8 months were studied radiographically and histologically. Clinically, animals with a fracture of the anconeal process had a "tight," restricted gait. In pigs at 4.5 months of age, a radiolucent line through the base of the anconeal process was composed of fibrocartilage, fibrous connective tissue, and hyaline cartilage. Subperiosteal proliferation of woven bone was located along the cranial surface of the olecranon, adjacent to the base of the anconeal process. In older animals, the radiolucent line through the anconeal process contained variable amounts of fibrous connective tissue and fibrocartilage. The proliferation of subperiosteal bone at the base of the anconeal process formed a "buttress callus" which retained a radiolucent area between the callus and the proximal surface of the anconeal process. The latter region of radiolucency was continuous with the transversely oriented line that traversed the base of the anconeal process.     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.