禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FADV-4)的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白(Hexon)基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。     

Ⅰ群禽腺病毒4型Penton基因的克隆及原核表达

通过对Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)血清4型毒株Penton基因的克隆及原核表达,获得可溶性表达的Penton蛋白。依据GenBank已公布的Ⅰ群禽腺病毒4型Penton全基因设计引物,对实验室保存有Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株进行PCR扩增及测序分析,并将Penton基因克隆至pCold-SUMO载体,然后进行诱导表达。测序结果及序列分析表明,Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株为近几年国内流行毒株的新型突变株,命名为SX17株(GenBank登录号为MF592716);SDS-PAGE电泳及Western blot结果表明,获得可溶性表达的Penton蛋白,且Penton蛋白表达、过柱的效果较好,分离后蛋白纯度可达到80%~90%。原核表达获得了可溶性表达的Penton蛋白,且纯化出的蛋白具有较高的纯度,为后续研究Ⅰ群禽腺病毒4型Penton蛋白的生物活性以及制备其蛋白抗体奠定了基础。     

血清4型禽腺病毒Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon)和五邻体蛋白(Penton)的串联蛋白及其多克隆抗体血清,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出Hexon基因和Penton基因,使用重叠PCR将Hexon基因和Penton基因串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到HP原核蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。SDS-PAGE分析显示,HP原核蛋白分子质量约为108 ku,Western Blot结果显示,HP原核蛋白可与His标签抗体和多克隆抗体血清特异性识别,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。     

K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005 bp ALV-K-gp85和510 bp ALV-K-gp85(fragment)基因.将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达.将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清.结果表明成功获得39.85和22.01 ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性.间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-K反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应.本试验首次研制获得能特异性识别ALV-K的单因子血清,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础.     

K亚群禽白血病病毒多克隆检测抗体的制备和特性分析

为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-Kgp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测血清抗体效价;对血清抗体进行纯化并检测抗体亚型,Western-blot和IFA检测抗体对ALV-Kgp85蛋白和病毒识别特性。结果表明,获得的抗体效价达到8×10~7,抗体亚型为IgG2b,该抗体能够特异性识别ALV-Kgp85蛋白和DF1细胞中的ALVK病毒,可以用于IFA临床检测,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。     

高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝...     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒σC基因,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理后与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a--σC.将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后通过Westem blot分析表明重组目的蛋白获得表达,分子量约为42 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白经纯化后免疫新西兰白兔,三次免疫获得抗σC蛋白的高效免疫血清.经ELISA检测,该血清抗体效价为1:105,并且能够与重组杆状病毒表达的σC蛋白发生特异性反应.禽呼肠孤病毒σC蛋白的表达与兔抗血清的制备为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.     

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber...     

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941 bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52 ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×10⁵。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。     

禽腺病毒血清4型纤突蛋白1(Fiber 1)多克隆抗体的制备

为了制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白1(Fiber 1)的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,将FAdV-4感染的病死鸡组织中扩增得到的Fiber 1基因构建到原核表达质粒pCold I,获得pCold I-Fiber 1表达质粒;然后将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中,加入1 mmol/L IPTG分别于16和37℃条件下诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示重组蛋白Fiber 1以包涵体的形式成功表达,分子质量约53 kDa。表达蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备得到兔源Fiber 1蛋白的多克隆抗体。Western blot检验结果表明制备的Fiber 1阳性血清1∶1 000倍稀释时具有良好的反应性,间接免疫荧光试验测得多抗血清在1∶3 000倍稀释时,仍具有较好的活性且特异性良好。本研究为后续FAdV-4检测方法的开发及其相关致病机制的研究奠定了物质基础。     

鸭源血清4型Ⅰ亚群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达与初步应用

为了获得鸭源血清4型禽腺病毒(FAdV-4)重组Hexon蛋白,并掌握重组蛋白的免疫学活性和应用前景,试验采用PCR方法、原核表达技术、Western-blot检测和间接ELISA方法对鸭源FAdV-4 Hexon蛋白的主要抗原区域进行截短表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:PCR方法扩增得到大小为1 011 bp的FAdV-4 Hexon主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白;重组蛋白变性纯化后进行Western-blot检测,其可与FAdV-4阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性;以纯化蛋白为包被抗原,初步建立检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法,用该方法进行检测,FAdV-4灭活疫苗免疫鸭场的免疫合格率为96.46%,FAdV-4感染鸭场的阳性感染率为99.46%,无FAdV-4免疫史和感染史鸭场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的FAdV-4 Hexon重组蛋白。     

血清4型禽腺病毒hexon-penton串联蛋白在293T细胞中的表达

为了获得293T细胞表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体(hexon)和五邻体(penton)的串联蛋白,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出hexon基因和penton基因,其大小分别为1 014,900 bp。使用重叠PCR将hexon基因和penton基因串联,得到hexon-penton(HP)串联基因。将HP基因导入表达质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-HP,转染293T细胞,获得HP真核蛋白。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定结果表明,HP真核蛋白可与多抗血清发生特异性反应,蛋白质相对分子质量约为90 000,HP串联蛋白在293T细胞中获得了良好表达。研究结果表明成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HP,并在真核细胞中获得表达,为进一步研制FAdV-4核酸疫苗奠定基础。     

禽网状内皮增生症病毒gp90基因真核表达及ELISA检测方法的建立

为建立禽网状内皮增生症病毒(REV)的ELISA检测方法,本研究通过RT-PCR方法扩增gp90基因,构建杆状病毒重组质粒,转化DH10Bac后,通过转座获得重组杆粒,并将其转染Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE及western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约为45 ku,具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA反应板,建立检测REV抗体的rgp90-ELISA方法。特异性试验结果表明该方法具有良好的特异性;将该方法与IDEXX公司生产的试剂盒共同检测包括63份已知背景的血清在内的黑龙江省和广东省的临床血清样品共477份,符合率分别为90.5%和86.4%。该方法的建立为禽群REV抗体的监测提供了方便、快捷、准确的技术手段。     

禽腺病毒4型hexon基因克隆与原核表达分析

应用PCR方法扩增禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4,FAd V-4) Hexon基因,将其克隆至原核表达载体p QE1中,获得重组质粒p QE1-hexon。将重组质粒经诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果,Hexon蛋白在25℃经诱导4 h、IPTG浓度为0. 8 mmol/L时可获得最大诱导表达量,表达蛋白的相对分子质量约为107 k D,主要以不溶性包涵体形式存在。纯化复性后,可得到浓度为5. 165 mg/m L及纯度为97%的Hexon蛋白。本研究获得的重组菌p QE1-hexon以及高纯度的Hexon蛋白,为进一步研究FAd V-4检测方法和新型疫苗奠定了基础。     

凋亡蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

在获得凋亡蛋白融合基因重组质粒pMD18-T-EGF-PⅡ-Apoptin的基础上,成功地构建了重组表达质粒pET-28a-EGF-PⅡ-Apoptin,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,结果表明,表达蛋白带位于33 kD处,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的40%.表达蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,对獭兔进行常规免疫,应用ELISA检测到较高的多克隆抗体效价,表明此蛋白具有良好的抗原性.Westem blot结果显示,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合.     

禽腺病毒4型鞭毛重组蛋白的原核表达及其免疫效果研究

为研究禽腺病毒4型重组鞭毛-fiber2蛋白免疫保护性,将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因与禽腺病毒4型的fiber2基因融合,再将融合基因和单独的fiber2基因分别克隆到原核表达载体p ET-28a,后将构建的p ET-28a-flagellin-fiber2和p ET-28a-fiber2重组载体分别转入大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,再将表达产物纯化后免疫21日龄SPF鸡;结果表明,重组菌在37℃培养条件下1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h可表达最多的可溶性重组蛋白,Western Blot分析表明,所表达的重组蛋白均能与禽腺病毒血清4型感染阳性血清发生特异性反应,说明所表达蛋白具有良好反应原性,动物试验表明,表达的两种目的蛋白能为鸡提供一定保护力,且低剂量的重组鞭毛-fiber2蛋白产生较好的免疫保护效果。     

4型禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

以4型禽腺病毒(FAdV-4)的DNA为模板,扩增其六邻体(hexon)部分基因并进行重组表达,以重组hexon蛋白为包被抗原,优化ELISA检测条件,建立了FAdV-4的ELISA抗体检测方法。该方法对FAdV-4阳性血清检测为阳性,对于其他鸡常见病毒,如禽流感病毒5、7、9型,新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒阳性血清检测均为阴性;与PCR方法的阳性符合率为83.3%。试验表明,建立的以重组hexon蛋白为包被抗原检测FAdV-4血清抗体的ELISA方法可以用于检测FAdV-4的感染及相关流行病学调查。     

鸡补体C3d抗血清的制备与应用

为探讨补体因子C3d在家禽健康诊断中的意义,将鸡补体因子C3d全长基因克隆到原核表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-C3d,然后将pET28a-C3d转化到大肠埃希菌BL21(DE3)并以IPTG诱导表达。表达产物采用氯化钾染色切胶法进行纯化,获得分子质量约35ku的C3d目的蛋白。将所得蛋白与弗氏佐剂制备疫苗免疫小鼠,制备抗鸡补体因子C3d血清。用制备的血清与重组杆状病毒表达的C3d蛋白进行Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定血清的特异性。进一步应用该血清对不同健康状态的鸡血清进行C3d相关补体成份相对含量的检测。结果鸡补体因子C3d在大肠埃希菌中成功表达,纯化的C3d蛋白免疫小鼠后制备的抗血清经ELISA检测抗体效价达1∶256 000。Western blot和IFA结果显示,该血清能与重组杆状病毒表达的C3d蛋白发生特异性反应。临床应用试验表明,该血清不仅能用于检测不同健康状态鸡血浆中C3d的表达状况,还能用于ELISA检测不同鸡血清中C3d相关补体成分的相对含量差异。研究还证实鸡血浆中C3d相关补体成分的表达因机体免疫状态不同而存在差异,结果为了解C3d与鸡体健康状况之间的关系提供了依据。     

共表达猪流行性腹泻病毒S1与GM-CSF蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1与GM-CSF融合基因的重组腺病毒,通过FMDV的2A基因序列做为Linker将密码子优化的S1基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因连接。构建重组穿梭质粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m),并将其电转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183感受态细胞中,通过同源重组制备重组腺病毒质粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒rAd-GMCSF2A-S1。间接免疫荧光和Western blot结果显示,S1和GMCSF蛋白在重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中获得表达。该重组腺病毒的制备为PEDV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌外膜蛋白C的原核表达与免疫反应性分析

利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30a-C原核表达重组质粒,转化BL21表达菌后,通过IPTG诱导获得以包涵体形式存在的重组蛋白,重组蛋白纯化后免疫印迹检测显示具有良好的反应原性。本研究为鸡白痢基因工程抗原的制备及诊断试剂研究奠定了基础。