粉纹夜蛾培养细胞对家蚕微孢子虫的吞噬及与孢壁蛋白的关系

解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子后的Tn培养细胞培养物总蛋白进行SDS-PAGE分析,证实经0.2mol/LKOH预处理的Nb孢子可以被Tn培养细胞所吞噬。对Nb孢子孢壁蛋白的SDS-PAGE分析显示,Nb孢子经KOH预处理后,大小为80kD和12kD的孢壁蛋白带缺失或明显减弱,30kD的孢壁蛋白带丰度降低。推测KOH预处理使Nb孢子部分孢壁蛋白被分解(部分或完全)或使蛋白结构发生变化,由此影响了Nb孢子与Tn培养细胞的相互作用关系,有利于Tn培养细胞对Nb孢子的吞噬。     

家蚕丝腺单病斑的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)在昆虫细胞中的感染增殖观察

从家蚕丝腺上取下家蚕微孢子虫单病斑,将其接种于昆虫培养细胞(Sf21、BmN)中进行培养,并使其所增殖的微孢子在细胞中进行扩大培养和传代.同时,对家蚕微孢子在培养细胞中感染增殖及寄生细胞的形态变化进行观察.     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)向家蚕BmN细胞接种与增殖的观察

利用DIPA活体荧光染色的方法对家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis)的体外发芽、侵染、增殖的过程进行了观察。结果表明 :侵染过程从发芽开始持续到感染后 2 4h ,感染初期的芽体具有二核性 ,随后合二为一 ,感染后 2 4h进入裂殖体增殖阶段形成多核裂殖体 ,感染后 5 4h出现孢子母细胞、短极丝孢子及孢内发芽现象 ,感染后 6 0h出现二次感染体及趋于成熟的孢子 ,感染后 96h开始形成大量的成熟孢子、空孢壳及二次感染体的再分裂 ,此时在感染家蚕BmN细胞中 ,难于明确划分家蚕微孢子虫的各发育阶段。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备

海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。     

微孢子虫的侵染机制

蜂微孢子虫病是蜜蜂的检疫性病害,该病严重阻碍了蜂群的生产繁殖.微孢子虫孢子侵入寄主细胞有3种方式:发芽侵染、自发感染、细胞内吞感染,又以发芽侵染为主.微孢子虫孢子表面蛋白与孢子发芽密切有关,找到孢子表面发芽关键蛋白将有助于揭示微孢子虫的侵染机制.     

家蚕微孢子虫水通道蛋白基因NbAQP的克隆及表达特征分析

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是在动物、植物、微生物细胞膜上发现的能够高选择性透过水分的一类通道蛋白。通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的AQP基因,并分析其表达特征,为研究AQP在Nb孢子侵染宿主细胞时调节孢子内渗透压的作用积累基础信息。依据从Microsporidia DB和MIPModDB数据库比对获得的序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了NbAQP基因,该基因大小为750 bp,编码蛋白质分子质量为26.66 k D,具有MIP超家族水通道蛋白的保守跨膜结构域。用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法,在Nb孢子感染宿主家蚕的7 d内,家蚕中肠组织中都能检测到NbAQP基因的表达,自感染后2 d开始,NbAQP基因的表达水平开始明显上升,直至感染后7 d达到最高水平。NbAQP基因的高水平表达时相与家蚕添食Nb孢子后中肠组织中成熟Nb孢子大量出现的时间相一致,初步推测NbAQP可能在家蚕微孢子虫成熟孢子发芽时的孢子内渗透压调节中起到重要作用。     

微孢子虫侵染研究进展

微孢子虫种类繁多,侵染寄主过程十分复杂,pH值、离子种类及浓度、温度、射线等都能激活孢子发芽侵入寄主.近年来微孢子虫侵染机理研究已从激活因子推进到孢子生理生化的研究.研究表明:微孢子虫孢内糖类物质浓度的变化与孢子内压升高,诱发极丝的弹出密切相关;同时,微孢子虫孢子的表面蛋白、极膜和极管蛋白(PTP)在孢子侵染寄主过程中扮演着重要角色.     

家蚕微孢子原虫(Nosema bombycis)在Antheraea eucalypti细胞中的增殖

家蚕微孢子原虫（ Ｎｏｓｅ ｍ ａ ｂｏ ｍ ｂｙｃｉｓ） 经 Ｋ Ｏ Ｈ 处理后,接种于 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系,调查其生活史。 Ｋ Ｏ Ｈ 处理的孢子发芽率约为４４３ ％ 、 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞的初期感染率约为３０ ％ ,接种３６ｈ 后,裂殖子数量急速增加,７２ｈ 达到最高峰。接种４８ｈ 后可观察到短极丝孢子发芽后形成的空孢壳和二次感染体。感染 Ｎｏｓｅｍ ａ ｂｏ ｍｂｙｃｉｓ ４８ｈ 前的家蚕血淋巴对 Ｂｍ Ｎ 细胞无感染性,而感染７２ｈ 的血淋巴则表现出感染能力。     

35℃高温对家蚕微孢子虫在BmN细胞中发育、增殖的抑制

研究了 35℃高温处理对家蚕微孢子虫体外发育、增殖的影响时期和时间。结果表明 :35℃高温对家蚕微孢子虫体外发育、增殖具有明显的抑制作用 ,其最为敏感的时期是微孢子虫的裂殖体增殖阶段 (接种后 2 4～ 72h) ,进入孢子形成期 (接种 72h以后 )抑制作用则明显降低。     

家蚕微粒子孢子单克隆抗体的研制及其在检测上的初步应用

将家蚕微粒子Nosema bombycis孢子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和FO细胞融合,经克隆筛选获得6株能稳定分泌抗N.bombycis孢子表面抗原的单克隆抗体细胞株(Nb_(1-6))。其中Nb_(1-2)和Nb4分泌的抗体属于IgM,Nb_3,Nb_5和Nb_6分泌的分别为IgG_2b、IgG和IgG_3。特异性检查结果表明,除Nb_4和Nb_6对柞蚕微粒子孢子有交叉凝集反应外,其余均对家蚕N.bombycisJ孢子具特异性。杂交瘤细胞培养上清液对N.bombycis孢子的凝集效价以Nb_1为最高,达1:256,由此细胞株诱发的腹水效价高达1:5000。建立了以普通聚苯乙烯酶标板为载体,完整的N.bombycis孢子为抗原的LEISA测定方法,最低检测量为700个孢子。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

从野外昆虫体内分离的5株微孢子虫的生物学特性与分子系统发育研究

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的体内收集到5株对家蚕有一定食下感染力的微孢子虫,通过生物学性状、分子系统发育研究,为其分类鉴定提供依据。来自野外昆虫的5株微孢子虫均具有Nosema属的生物学特性:显微镜下观察形状均呈长卵圆形,与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)有较明显差异;在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,最后形成双核成熟孢子;与Nb抗血清均产生阳性凝聚反应;超微结构观察均具双核,极丝圈数在12～14圈之间,极丝倾斜角与Nb有差异。根据5株野外昆虫微孢子虫与其它昆虫微孢子虫基于SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及基于SSU rRNA和rRNA ITS基因序列进行的相似性和遗传距离分析,初步认为5株野外昆虫微孢子虫与家蚕微孢子虫同属异种。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

家蚕肠球菌体外抑制微孢子发芽的动力学研究

研究表明,家蚕微孢子的浓度(y)与孢子悬浮液的吸光值(OD_(625))(x)之间的函数关系可用y=2.712×1O~6x来表示,即可用分光光度计法快速准确地测定孢子的发芽率。微孢子在不同处理液中发芽的动力学曲线显示:经磷酸缓冲液、培养基的透析液或培养基的20％～80％饱和废硫酸铵盐析蛋白质处理微孢子在8min之内快速发芽;而经肠球菌培养上清液的透析液或培养上清液的20％～80％饱和度硫酸铵盐析蛋白质处理的微孢子在30min内发芽十分缓慢,两者对孢子发芽的最终相对抑制率分别达到65.95％和70.08％;抑制微孢子发芽的活性物为肠球菌的外分泌物,其分子量在3.5kD以上,具有良好的热稳定性。研究结果初步揭示了肠球菌外分泌物质抑制家蚕微孢子发芽的动力学机制。     

中国广东家蚕微粒子孢子在Antheraea eucalypti细胞系的感染增殖

将中国广东的Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ,用０２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ 处理后,接种感染Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系。孢子的发芽率达８７％ ,在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞初期感染率为２７ ％ 。发育各阶段具２ 核,可观察到短极丝孢子和二次感染体形成,孢子芽母细胞按二分裂形成２ 个双核的孢子芽,具典型 Ｎｏｓｅｍａ 属特征。Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ 生物学特性、血清学类型与日本Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＮＩＳ００１ 大致相同,但孢子大小、裂殖体的形态、在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞寄生的细胞感染率、每个细胞的产孢数,２ 种微孢子虫却有差异。