家蚕肠球菌对微孢子虫体外发芽的抑制作用

肠球菌在家蚕消化道内的高频分布和具有丰富表型的特点 ,使其成为家蚕病害生物防治的良好可利用微生物。本试验从家蚕细菌性肠道病病蚕消化道内分离了甘露醇酵解酶、山梨醇酵解酶和糖元酵解酶表型不同的4个肠球菌菌株。菌株培养上清对家蚕微孢子虫的体外孢子发芽抑制试验表明 :肠球菌对家蚕微孢子虫孢子的发芽具有较强的抑制作用 ,抑制效果的绝对值达 31 4 9%～ 4 3 5 6 % ,相对值达 4 8 18%～ 5 0 5 6 % ,菌株间未显示明显差异     

微粒子病家蚕消化道内肠球菌的分布

从健康家要、感染微粒子病家蚕,以及感染细菌性肠道病家蚕的消化道分离了200株肠球菌,并进行了数值分类学鉴定,以探讨家蚕消化道中肠球菌的生态学分布和家蚕微孢子与肠球菌的相互关系。研究结果表明:与健康蚕相比,4龄或5龄起蚕添食微孢子的微粒子病家蚕消化道内,肠球菌的数量分别增加5.5×10~5倍和0.74×10~2倍;菌种数从6个分别下降为3个和4个;生化表型数从27个分别下降为13个和14个;在菌种分布上,Ent.avium的分布频率从健康蚕的56％分别下降至20%和38%,而Ent.faecium的分布频率从健康蚕的2％分别上升至40％和16%;分离菌株共有59个生化表型。     

饲用粪肠球菌培养基及发酵条件的优化研究

为提高饲用粪肠球菌发酵活菌数,通过单因素试验和正交优化试验对粪肠球菌的培养基和发酵条件进行优化.确定最佳发酵培养基为蛋白胨3.2％,酵母粉1％,葡萄糖2.8％,吐温-80 1 ml/L,柠檬酸三铵0.2％,七水硫酸镁0.02％,一水硫酸锰0.005％,碳酸钙1.0％.最佳发酵条件为培养基初始pH(7.1+0.1),接种量2.5％～5.0％,温度34～37℃,150 r/min振荡培养.在最佳培养基和发酵条件下,粪肠球菌活菌数最高可达8.5×109 cfu/ml.     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

家蚕微孢子原虫在Antheraea eucalypti细胞中的增殖

家蚕微孢子原虫经ＫＯＨ处理后,接种于Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ细胞系,调查其生活史,ＫＯＨ处理的孢子发芽率约为４４．３％,Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ细胞的初期感染率约为３０％,接种３６ｈ后,裂殖子数量急速增加,７２ｈ达到最高峰。接种４８ｈ后可观察到短极丝孢子发芽后形成的空孢壳和二次感染体。感染Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ４８ｈ前的家蚕血淋巴对ＢｍＮ细胞无感染性,而感染２     

家蚕微孢子虫水通道蛋白基因NbAQP的克隆及表达特征分析

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是在动物、植物、微生物细胞膜上发现的能够高选择性透过水分的一类通道蛋白。通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的AQP基因,并分析其表达特征,为研究AQP在Nb孢子侵染宿主细胞时调节孢子内渗透压的作用积累基础信息。依据从Microsporidia DB和MIPModDB数据库比对获得的序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了NbAQP基因,该基因大小为750 bp,编码蛋白质分子质量为26.66 k D,具有MIP超家族水通道蛋白的保守跨膜结构域。用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法,在Nb孢子感染宿主家蚕的7 d内,家蚕中肠组织中都能检测到NbAQP基因的表达,自感染后2 d开始,NbAQP基因的表达水平开始明显上升,直至感染后7 d达到最高水平。NbAQP基因的高水平表达时相与家蚕添食Nb孢子后中肠组织中成熟Nb孢子大量出现的时间相一致,初步推测NbAQP可能在家蚕微孢子虫成熟孢子发芽时的孢子内渗透压调节中起到重要作用。     

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。     

屎肠球菌素E9的产生和特性研究

用琼脂扩散法分别检测了不同培养时间的屎肠球菌E9无细胞上清液和连接在菌体上的Enterocin E9活性,同时分析了Enterocin E9的生物学特性。结果显示：含Enterocin E9的上清液和菌体都具有抑菌活性,活性大小存在浓度依赖性。在一定时间范围内,其上清液和菌体的活性都随着培养时间的增加而逐渐升高。取上清液进行稳定性分析,结果发现Enterocin E9有很好耐热和耐酸碱性,经121℃处理20 min后其活性仍大部分保留,在pH2~12的范围内37℃下处理4 h仍保持较高活性;不同浓度的吐温-80对其活性无明显影响;室温放置7周后,活性无明显变化。上述实验说明屎肠球菌E9产生的细菌素不仅分泌到上清液中,同时还有较大部分与菌体结合。Enterocin E9稳定性良好,储藏条件简单,具有在畜牧业中应用的潜能。     

防微灵防治家蚕微粒子病机理研究初报

生物试验结果和以Giemsa液染色感病蚕体组织涂片的现察结果表明,防微灵对家蚕微粒子孢子无体外灭活作用,亦无预防效果,对孢子进入蚕体后的发芽和入侵组织无影响,蚕体内孢子发育进入孢子形成期再连续给药也无治疗效果,防微灵治疗家蚕微粒子病的作用阶段是抑制繁殖体的分裂增殖。     

鸡蛋清卵铁传递蛋白的分离纯化

采用硫酸铵沉淀法和阴离子交换层析法从鸡蛋清内提取高纯度卵铁传递蛋白。结果表明：采用水稀释和硅藻土过滤澄清蛋清液,并结合微滤、超滤的预处理方法,去除蛋清中的黏蛋白等杂蛋白,然后采用不同饱和度的硫酸铵对上清液进行了定量盐析条件的试验,确定60%饱和硫酸铵为最佳试验条件;加入60%饱和硫酸铵盐析得到卵白蛋白粗品,上清液用DEAE-sepharose F.F.离子交换层析,分离得到卵铁传递蛋白,SDS-PAGE电泳检测达到95%以上纯度,凝胶过滤柱测定相对分子量为76000。该研究为实现蛋清中蛋白质的连续化提取奠定了基础。     

几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制

通过5种对家蚕微孢子虫发育有抑制作用的化学药剂--脓微灵、防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛不同处理时期、时间在体外对家蚕微孢子虫发育、增殖影响的研究表明：供试的5种化学药剂对家蚕微孢子虫体外发育、增殖均产生不同程度的抑制作用。脓微灵的显抑制作用的时期表现在从接种0h开始的处理区，孢子形成数仅为对照的11.89%～15.68%，主要体现为对微孢子虫、芽体的杀灭作用或对微孢子发芽的抑制作用。防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛对家蚕微孢子虫体外发生、增殖抑制作用最显的时期，均表现在接种24h～72h，从裂殖体分裂、增殖到孢子形成期之前这一对外界环境条件的变化最为敏感的发育阶段，尤以48h～72h最有效，其孢子形成数为对照的22%～38%。而抑制作用与化学药剂作用时间长短的相关性则不十分明显。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

家蚕微粒子孢子单克隆抗体的研制及其在检测上的初步应用

将家蚕微粒子Nosema bombycis孢子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和FO细胞融合,经克隆筛选获得6株能稳定分泌抗N.bombycis孢子表面抗原的单克隆抗体细胞株(Nb_(1-6))。其中Nb_(1-2)和Nb4分泌的抗体属于IgM,Nb_3,Nb_5和Nb_6分泌的分别为IgG_2b、IgG和IgG_3。特异性检查结果表明,除Nb_4和Nb_6对柞蚕微粒子孢子有交叉凝集反应外,其余均对家蚕N.bombycisJ孢子具特异性。杂交瘤细胞培养上清液对N.bombycis孢子的凝集效价以Nb_1为最高,达1:256,由此细胞株诱发的腹水效价高达1:5000。建立了以普通聚苯乙烯酶标板为载体,完整的N.bombycis孢子为抗原的LEISA测定方法,最低检测量为700个孢子。     

微孢子虫的发芽及对细胞的感染性

M32 (Thelohantia)、Nosemabombycis、M12 (Vairimorpha)和来自大菜粉蝶 (PierisbrassicaeLinnaeus)的微孢子 (PBL)经KOH或EDTA法诱导后 ,调查其在PBS、TEK或Grace培养液中的发芽率和对Bm、Antheraeaeucalypti细胞的侵染性。结果表明 ,同一种发芽方法 ,4种微孢子的发芽率存在明显差异 ;发芽培养液不仅影响发芽率 ,而且也影响微孢子原虫对细胞的感染性。     

家蚕微孢子虫蛋白水解酶的活性检测及质谱鉴定和序列分析

微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶类的活性。采用质谱法分析该类蛋白酶主要是锌离子依赖型的细胞质型亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶。细胞质型亮氨酰氨肽酶序列是由1 515个碱基编码的505个氨基酸组成,无信号肽,有2个潜在的锌离子结合部位,属于金属蛋白酶M17家族;丝氨酸蛋白酶具有肽酶S8结构域和跨膜域。通过序列比对发现在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中均有这2种酶,且相似度较高,其进化较为保守。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)向家蚕BmN细胞接种与增殖的观察

利用DIPA活体荧光染色的方法对家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis)的体外发芽、侵染、增殖的过程进行了观察。结果表明 :侵染过程从发芽开始持续到感染后 2 4h ,感染初期的芽体具有二核性 ,随后合二为一 ,感染后 2 4h进入裂殖体增殖阶段形成多核裂殖体 ,感染后 5 4h出现孢子母细胞、短极丝孢子及孢内发芽现象 ,感染后 6 0h出现二次感染体及趋于成熟的孢子 ,感染后 96h开始形成大量的成熟孢子、空孢壳及二次感染体的再分裂 ,此时在感染家蚕BmN细胞中 ,难于明确划分家蚕微孢子虫的各发育阶段。