云岭黑山羊BMPR-IB基因部分编码区的克隆及多态性分析

应用RT-PCR方法从云岭黑山羊卵巢组织克隆与产羔性状相关的BMPR-IB基因。结果表明,克隆的BMPR-IB基因扩增片段长467 bp,扩增片段位于该基因编码区第497与963位碱基之间,与已报道的野生型山羊、绵羊、猪、人和鼠的BMPR-IB基因该编码区的同源性分别为99%、99%、92%、92%和87%;与野生型山羊相比,云岭黑山羊BMPR-IB基因第498位和575位碱基存在多态性位点,其中第498位碱基由T突变为C,组成的密码仍编码天冬氨酸（Asp,D）,为同义突变;第575位碱基由C突变为T,编码的氨基酸由脯氨酸（Pro,P）变为亮氨酸（Leu,L）,为错义突变;BMPR-IB蛋白的二级结构在错义突变位点可能具有多种构象。本研究结果为深入研究BMPR-IB基因与云岭黑山羊产羔性状间的关系奠定了基础。     

肥羔型黑山羊骨调素基因部分序列克隆及生物信息学分析

为了研究山羊骨调素(OPN)基因的分子生物学特性,试验采集肥羔型黑山羊卵巢组织,提取总RNA,扩增OPN基因序列,并进行生物信息学分析。结果表明:通过PCR扩增得到肥羔型黑山羊OPN基因的部分基因片段,长度为949 bp,其中编码区为840 bp,共编码279个氨基酸;肥羔型黑山羊OPN蛋白的分子式为C1312H2054N372O499S5,相对分子质量为31.18,属于亲水性蛋白,其信号肽切割位点位于18~19个氨基酸之间。肥羔型黑山羊OPN基因与绵羊、牛相应序列的相似性分别为98%、94%。     

金堂黑山羊LPL基因克隆及其序列分析

实验利用RT-PCR方法成功克隆了金堂黑山羊的LPL基因序列,全长1 641 bp.对其进行生物信息学分析表明,金堂黑山羊的LPL基因ORF(开放阅读框)长1 437 bp,编码478个氨基酸;与普通山羊、牛、小鼠等哺乳动物相比,核酸同源性为85.5%～99.9%,氨基酸同源性为89.5%～99.8%.两处比较均表现为:与普通山羊的同源性最高,与小鼠的同源性最低;与普通山羊相比,核酸序列只存在第64个核酸发生(A/G)突变,从而导致第22位氨基酸发生(H/R)突变.乙酰化位点分析表明,金堂黑山羊LPL乙酰化位点与其他物种一样,均为第3个氨基酸(丝氨酸).说明金堂黑山羊LPL基因存在种间保守性和特异性.     

贵州黑山羊LYRM1基因生物信息学及组织表达分析

采用RT-PCR的方法对贵州黑山羊LYRM1基因进行了克隆,并对该基因的编码区序列进行生物信息学分析,利用qRT-PCR的方法检测LYRM1基因在贵州黑山羊不同组织中mRNA的相对表达量以及在不同月龄的时序表达。结果:黑山羊LYRM1基因的编码区全长369 bp,编码122个氨基酸,编码蛋白分子质量为14.4 kDa,理论等电点为9.73,不稳定系数为49.48,为不稳定蛋白;与GenBank数据库中提供的山羊LYRM1基因的编码区序列匹配度为99%,存在2个碱基的突变,分别为第177位和242位;通过LYRM1基因系统进化树得知,黑山羊与牛的进化距离较近,与斑马鱼进化距离较远。qRT-PCR结果显示LYRM1基因在贵州黑山羊7个组织中均有表达,在脂肪组织的表达量最高,背最长肌中的表达量最低;时序表达结果表明,LYRM1基因在黑山羊脂肪组织的整体表达趋势为先增加再减少,6月龄的表达量最高,7日龄最低。本试验成功克隆了黑山羊LYRM1基因编码区并进行了生物信息学分析,且检测了其在黑山羊不同组织中的表达以及在脂肪组织中的时序表达,为深入研究LYRM1基因功能奠定基础。     

会理黑山羊肌肉生长抑制素基因编码序列的克隆与多样性分析

为探究会理黑山羊遗传分化状况,试验参考普通山羊肌肉生长抑制素（MSTN）基因设计引物,采用PCR方法扩增、克隆会理黑山羊MSTN基因编码区,并与其他物种相应基因编码区核苷酸序列进行比对分析。结果表明,会理黑山羊MSTN基因完整编码序列长度为1128 bp,由外显子1（372 bp）、外显子2（375 bp）和外显子3（381 bp）组成;会理黑山羊与建昌黑山羊、黔北麻羊同源性最高,均达97.4%,聚为一簇,亲缘关系最近,与牛、恒河猴、狗等物种的同源性最低,亲缘关系远;会理黑山羊MSTN基因编码区共编码375个氨基酸,会理黑山羊MSTN基因编码的各种氨基酸含量相差较大,其中以亮氨酸含量最丰富,达8.80%。本研究为会理黑山羊的遗传资源保护、开发与利用提供了分子遗传学研究基础。     

山羊Kiss-1和GPR54基因的克隆及组织表达研究

为探究Kiss-1和GPR54基因在山羊季节性繁殖中的作用,分别在四川省金堂县和理县各选取5只10月龄处于发情前期的藏山羊和金堂黑山羊为研究对象,对Kiss-1和GPR54基因编码区进行序列及组织表达分析。结果显示:金堂黑山羊和藏山羊Kiss-1基因编码区均长408 bp,编码135个氨基酸,两品种间存在2处同义突变。GPR54基因编码区均长244 bp,编码81个氨基酸,两品种间存在1处同义突变;金堂黑山羊Kiss-1和GPR54基因CDs区核苷酸序列与藏山羊的同源性分别为99.5%、99.6%;Kiss-1和GPR54基因在两品种山羊的卵巢、子宫、输卵管、垂体中均有表达,但只有Kiss-1基因在金堂黑山羊垂体中的表达量显著高于藏山羊(P0.05),而在其他组织品种间差异不显著(P0.05)。提示:Kiss-1基因可能参与调控山羊季节性繁殖,而GPR54基因是否是引起季节性繁殖的原因还有待进一步研究。     

伏牛白山羊TACR1基因扩增及生物信息学分析

本研究旨在克隆伏牛白山羊TACR1基因,并对其结构和编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步研究TACR1基因的功能及其在生殖生理和免疫调节中的作用奠定基础。根据GenBank中已发表的山羊TACR1基因(登录号:NC_030818.1)序列设计引物,对伏牛白山羊TACR1基因进行分段PCR扩增并测序,拼接后得到包含TACR1基因完整编码区的序列片段。结果表明,伏牛白山羊TACR1基因开放阅读框(ORF)全长852bp,共编码283个氨基酸,碱基组成为:A(23.47%)、T(25.49%)、C(27.76%)和G(23.27%)。与绵羊相比,伏牛白山羊TACR1基因编码区发生了2个碱基突变,但没有引起氨基酸的改变。5′端非编码序列长为860bp,发生了9个碱基突变;3′端非编码序列长为271bp,发生了2个碱基突变。同源性分析结果显示,伏牛白山羊与卡普拉山羊、藏羚羊、绵羊、瘤牛、白尾鹿、白鳍豚、人、野猪、金钱豹、土拨鼠、野驴TACR1基因同源性分别为99.9%、99.3%、99.2%、97.5%、96.7%、92.9%、89.7%、88.6%、86.3%、86.2%和85.0%。SignalP 4.1在线软件预测结果显示,TACR1N末端存在信号肽且可能在21位氨基酸处存在裂解位点;蛋白质结构预测发现伏牛白山羊TACR1基因编码蛋白没有跨膜结构域。     

伏牛白山羊TACR1基因扩增及生物信息学分析

本研究旨在克隆伏牛白山羊TACR1基因,并对其结构和编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步研究TACR1基因的功能及其在生殖生理和免疫调节中的作用奠定基础。根据GenBank中已发表的山羊TACR1基因（登录号：NC_030818.1）序列设计引物,对伏牛白山羊TACR1基因进行分段PCR扩增并测序,拼接后得到包含TACR1基因完整编码区的序列片段。结果表明,伏牛白山羊TACR1基因开放阅读框（ORF）全长852 bp,共编码283个氨基酸,碱基组成为：A（23.47%）、T（25.49%）、C（27.76%）和G（23.27%）。与绵羊相比,伏牛白山羊TACR1基因编码区发生了2个碱基突变,但没有引起氨基酸的改变。5'端非编码序列长为860 bp,发生了9个碱基突变;3'端非编码序列长为271 bp,发生了2个碱基突变。同源性分析结果显示,伏牛白山羊与卡普拉山羊、藏羚羊、绵羊、瘤牛、白尾鹿、白鳍豚、人、野猪、金钱豹、土拨鼠、野驴TACR1基因同源性分别为99.9%、99.3%、99.2%、97.5%、96.7%、92.9%、89.7%、88.6%、86.3%、86.2%和85.0%。SignalP 4.1在线软件预测结果显示,TACR1 N末端存在信号肽且可能在21位氨基酸处存在裂解位点;蛋白质结构预测发现伏牛白山羊TACR1基因编码蛋白没有跨膜结构域。     

会理黑山羊Hoxc9基因克隆与分析

为了探索Hoxc9基因在会理黑山羊毛囊生长发育中的机制,试验采用PCR方法从会理黑山羊血液中扩增Hoxc9基因,经克隆、测序、拼接并进行生物信息学分析。结果表明:会理黑山羊Hoxc9基因核苷酸序列长度为3 198 bp,由2个外显子和1个内含子组成,其中外显子分别为1 035 bp、507 bp,内含子为1 656 bp,与哺乳类动物同源性达96%以上。     

绵羊ADPN基因和PTGS2基因多态性与产羔数相关性研究

实验旨在研究ADPN基因和PTGS2基因与湖羊和杜泊羊产羔数的相关性,采用直接测序法检测65只湖羊和60只杜泊羊的ADPN基因的第3外显子以及PTGS2基因的第3外显子到第5外显子的多态性,并分析其与产羔数的相关性。结果表明:湖羊在ADPN基因第3外显子的133 bp处突变的密码子由GAT转变成AAT,并使编码的氨基酸由D(天冬氨酸)转变成N(天冬酰胺);在594bp处突变的密码子由AGA转变为AAA,使编码的氨基酸由R(精氨酸)转变为K(赖氨酸);湖羊在PTGS2基因第3外显子的77 bp位点的密码子由AAA转变为CAA,并使编码的氨基酸由K(赖氨酸)转变为Q(谷氨酰胺);但在杜泊羊群体中并没有发现基因的突变。因此推测ADPN基因和PTGS2基因可能是引起湖羊高繁殖力的基因。     

山羊CXCR1基因的克隆及组织表达谱研究

为了探究山羊C-X-C趋化因子受体1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)基因的特点,试验以金堂黑山羊脾脏cDNA为模板克隆了CXCR1基因,借助生物信息学软件及在线软件分析序列,并采用实时荧光定量PCR方法检测CXCR1基因在金堂黑山羊脾脏、肺脏、肌肉、心脏和肠的5个组织中的相对表达量。结果表明:克隆得到的CXCR1基因序列全长为1 140 bp,完整CDS编码区长1 107 bp,共编码368个氨基酸;所得氨基酸序列与牛进行比对,两者同源性为96.8%;编码蛋白为带正电荷、具有疏水性的稳定蛋白;有7个跨膜结构和32个磷酸化位点,无信号肽;二级结构中α-螺旋比例最高,为54.35%;获得的三级结构模型与人的CXCR1蛋白(PDB:2lnl.1.A)同源性最高,为81.49%;氨基酸比对结果与系统进化树结果相近,金堂黑山羊与牛的亲缘关系最近;CXCR1基因主要表达于肌肉和心脏。说明CXCR1基因可能在山羊肌肉发育相关的信号通路中发挥作用。     

贵州黑山羊RERG基因cDNA克隆与序列分析

选择与羊同源性较高的牛RERG基因组序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对RERG基因进行克隆测序及序列分析。结果:首次克隆了贵州黑山羊RERG基因cDNA序列629 bp,GenBank登录号为JN672576,编码199个氨基酸;贵州黑山羊RERG基因蛋白与牛的同源性高达98.5%;聚类分析表明RERG基因编码区适于构建种间系统进化树。     

绵羊FGF5基因SNP的生物信息学分析

研究利用PCR-SSCP方法检测了FGF5基因在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴羊等绵羊品种单核苷酸多态性。结果表明:FGF5基因在P1引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性并引起编码氨基酸的改变。经克隆测序分析,位于P1引物扩增片段内存在G→T突变,该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变对引起编码氨基酸的P1位点进一步进行了生物信息学分析,发现由于编码序列的改变引起蛋白质二级结构的变化,并引起限制性酶切位点的变化,但没有引起功能位点和三级结构的变化。     

贵州黑山羊独立生长因子1B基因cDNA克隆与生物信息学分析

选择与羊同源性较高的牛独立生长因子1B(GFI1B)基因序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对GFI1B基因进行克隆测序及序列分析。结果表明:首次克隆了贵州黑山羊GFI1B基因cDNA序列996 bp,GenBank登录号为JN662390,编码331个氨基酸。贵州黑山羊GFI1B基因与牛的同源性高达97.0%。聚类分析显示:哺乳动物、禽类和两栖类各为一类。生物信息学分析表明:山羊GFI1B分子包括1个低组分复杂性区域、6个锌指结构域ZnF-C4。同时,预测结果还表明GFI1B分子不包含信号肽序列且没有跨膜螺旋结构域,26个磷酸化位点,蛋白糖基化位点有7个。     

云上黑山羊28号染色体上3个SNPs位点多态性与产羔数性状的关联分析

为验证和挖掘山羊产羔性状的分子标记和主效基因,选取前期研究获得的位于云上黑山羊28号染色体上3个与产羔数性状存在潜在关联的SNPs位点（rs268286450、rs268286391和rs268244272）,采用MassARRAY飞行质谱列阵技术对541个云上黑山羊DNA样本进行SNP分型,并结合其产羔数进行关联分析。结果显示,3个SNPs位点均存在多态性,rs268286450位点在28号染色体第28 498 787 bp处发生C→T碱基突变,rs268286391位点在28号染色体第30 971 277 bp处发生A→C碱基突变,rs268244272位点在28号染色体第2 707 491 bp处发生T→C碱基突变,3个位点多态信息含量（PIC）分别为0.36、0.32和0.21;rs268286450和rs268286391位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.01）,而rs268244272位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;rs268244272位点存在3种基因型CC、TT和TC,TT基因型频率为0.75,为野生基因型,TC基因型频率为0.22,为突变基因型,3种基因型最小二乘均值比较显示,TC基因型产羔数最小二乘均值与TT基因型差异极显著（P<0.01）,与CC基因型差异不显著（P>0.05）,TT与CC基因型产羔数最小二乘均值差异也不显著（P>0.05）,TC基因型云上黑山羊产羔数上调。关联分析结果显示,rs268286450和rs268286391位点多态性与云上黑山羊产羔数关联不显著（P>0.05）,rs268244272位点多态性与产羔数性状存在显著相关（P<0.05）。综上,云上黑山羊28号染色体上rs268244272位点多态性与产羔数性状显著相关,可作为云上黑山羊产羔数性状的分子标记在其高繁品系选育中加以应用。     

山羊DQB1基因分析及其组织表达分析

为探究金堂黑山羊主要组织相容性复合体II类基因(MHC class II DQ-beta 1 chain gene,DQB1)的结构与功能,及其组织表达特征。本研究采用PCR扩增DQB1基因并对其进行生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术检测其在金堂黑山羊不同组织中的转录情况。结果显示:金堂黑山羊DQB1基因长度为786 bp,编码261个氨基酸。同源性分析显示金堂黑山羊DQB1基因与8个物种的相应基因同源性均达到85%以上,表明DQB1基因具有较高的保守性。荧光定量PCR结果显示,该基因在金堂黑山羊心脏组织中转录水平显著高于其在脾、肌肉、肠的转录水平(p0.01),表明DQB1基因在不同组织中的转录水平存在一定差异。本研究为进一步探究DQB1的免疫功能提供参考依据。     

和田羊毛囊KAP1.1基因的克隆及生物信息学分析

为了分析和田羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)1.1基因,试验以南疆地方品种羊(和田羊)为样本,从和田羊毛囊中提取总RNA,设计1对引物,通过PCR反应扩增出长度为535 bp的基因片段,连接到pMD18-T载体上。结果表明:克隆得到和田羊毛囊KAP1.1基因成熟蛋白编码序列,序列长度与GenBank上发表的序列长度相同,经生物信息学软件分析,有2处碱基发生突变,同源性为99%,说明试验成功克隆了KAP1.1基因。     

金堂黑山羊IFN-γ基因克隆与组织表达分析

为了解γ干扰素(IFN-γ)基因在金堂黑山羊体内的表达情况,采用RT-PCR法克隆金堂黑山羊IFN-γ基因,用ExPASy网站对其蛋白质结构进行生物信息学分析,并构建系统发育进化树,最后采用荧光定量PCR法检测了IFN-γ基因在健康金堂黑山羊5个组织器官中的表达情况。结果表明:金堂黑山羊IFN-γ基因长580 bp,蛋白质编码区(CDS区)为519 bp,共编码172个氨基酸,氨基酸序列有13个磷酸化位点,在第39位和第106位有2个糖基化位点,三级结构以α-螺旋为主,中间均匀夹杂着无规则卷曲,金堂黑山羊IFN-γ是一种带正电荷的不稳定的亲水性蛋白质;金堂黑山羊与山羊、绵羊、野水牛IFN-γ基因的开放阅读框(ORF)序列同源性均为98%;实时荧光定量PCR检测到IFN-γ在健康金堂黑山羊各组织器官中表达量不同,在脾脏中的相对表达量最高,在心脏和肌肉中几乎没有表达。说明IFN-γ基因较为保守,可能参与山羊的免疫应答反应。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物,以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板,应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列,并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明,PCR扩增获得的片断为1643bp,三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比,同源性分别为97.49%和97.41%,分别在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比,同源性为99.60%,且3个位点有碱基突变,其中 1184和 1365位点突变引起氨基酸密码改变。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。