猪瘟病毒流行株与疫苗株主要抗原编码基因差异研究

从全国7个省市1200多份可疑猪瘟病料中分离出9个猪瘟病毒（HCV）野毒株，编号分别为HCV－01－09。将9株野毒分别通过PK15细胞分别通过PK15细胞传6代，测其毒价，并提纯做电镜观察，结果表明：毒价范围在10^2-10^7TCID50，电镜观察均可清晰地见到直径为25－70nm，略呈圆形的病毒颗粒，具有较完整的囊膜和纤突结构。从9株野毒中选取5株经猪瘟阴性猪各传3－4代，测其毒力、病原性、致死性，结果表明：各毒株在传代中其上述生物学特性上有变化和差别。用猪瘟兔化弱毒疫苗分别对这5株野毒做免疫保护相关性试验，结果证明：攻毒后的疫苗接种猪100％保护，而攻毒对照猪100％死亡，且对照猪在攻毒1周后便出现猪瘟野毒感染，而免疫猪在整个观察期均未见到野毒感染。用不同剂量的猪瘟兔化弱毒，表明猪瘟兔化弱毒不通过胎盘垂直感染仔猪。将猪瘟野毒株、石门系强毒株、兔化弱毒株及1982年分离的郑州野毒等毒株进行主要抗原编码基因差异研究，结果表明：猪瘟病毒可分2个基因组6个基因亚组，HCV－02、03、06、07等4个野毒株与国内的C株、石门强毒株、国外的C株、日本GPE株、ALD株、意大利Brescia株均属同一基困组，而HCV－08株及郑州株等2个野毒与法国的Alfor株同属另一个基因组。     

猪瘟兔化弱毒疫苗的临床试验

1效力 用我国生产的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗免疫无猪瘟抗体及抗原的易感猪，每头皮下注射1头份，14天后分别攻击猪瘟野毒，每头皮下注射猪瘟血毒2毫升。结果表明，猪瘟弱毒细胞苗对9株野毒均具有坚强的保护力，免疫组100％保护，对照组76．5％死亡。以猪瘟荧光抗体法（HCFA）检查，     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。     

五株猪瘟病毒野外分离物的致病性

将５株猪瘟病毒野外分离物在无猪瘟病毒抗体幼猪中分别传代３－４代,此５株野毒都已在ＰＫ－１５细胞中传代６次并经过纯化．其中３株的第一代接种猪中、２株的第二代接种猪中出现猪瘟典型急性症状。此后各代分离物对猪的致病性呈稳定状态。与病猪同居的健康猪被感染并呈现相似的症状。     

猪瘟兔化弱毒疫苗的研究概况

猪瘟病毒兔化弱毒株因其优良的免疫原性,成为我国至今唯一使用的猪瘟疫苗株。本文就猪瘟兔化弱毒株的生物学特性、猪瘟兔化弱毒组织疫苗和细胞疫苗的研制以及疫苗的应用进行了综述。     

猪瘟疫苗的研究进展

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种猪的高度接触性、致死性传染病,以发热、白细胞减少、皮肤和粘膜出现大量出血点为主要特征。在世界许多国家和地区,传统疫苗接种是控制CSF的重要手段。目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE-疫苗和法国的Thireval疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗性能稳定、安全、免疫效果好，且无残留能力，是国际公认的唯一安全有效的弱毒疫苗，亦是国内唯一应用的弱毒疫苗。     

猪瘟野毒混合毒实验室感染的研究

本研究以本所近年来所分离的高、中、低三株不同毒力（HeNXH3.98、JL1.94和FJFQ1.99）的猪瘟野毒混合毒对敏感猪进行实验室感染试验，利用HCFA、RT－PCR及序列测定进行检测和分析，结果2头试验猪均在感染后2周发病死亡，表现典型的猪瘟临床症状；序列测定及分析结果表明感染后1周及2周2头实验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列完全一致，核苷酸及氨基酸同源性均为1005；与感染毒株序列比较，2头试验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列与JL1.94株序列完全一致，核苷酸及 在酸同源性均为100％，且基因分群在同一群；而与HeNXH3.98和FJFQ1.99株序列则有一定的差异，且不在同一基因群或基因亚群，说明在多个猪瘟病毒存在的情况下，敏感猪存在对猪间病毒的优势选择。本试验的条件下3株不同和的猪瘟野毒混合感染以中等毒力毒株JL1.94为优势毒株。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞旋转培养制造猪瘟冻干苗的研究

为了克服猪瘟兔化弱毒乳免疫苗成本高,易污染的缺点,弥补采用常规猪肾细胞制造猪瘟弱毒疫苗的潜在致病危险性。本文成功的在犊牛睾丸细胞上连续增殖猪瘟化弱毒,特别是利用次代或二代细胞进行转瓶堵养,收获的猪瘟兔化弱毒其毒价稳定,细胞不易老化脱壁。现已制成猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞培养冻干疫苗,生产工艺简单,成本较低。疫苗对猪的免疫原性良好,免疫期一年以上。性能稳定,在-15℃可保存13个月,4℃保存半年以上,25℃也可保存14天。经7691头猪的免疫接种试验,证明本苗安全,无一死亡,个别猪有反应,其反应率仅为0.74%。     

猪瘟组织灭活疫苗与猪瘟弱毒冻干活疫苗在免疫效力的比较研究

猪瘟是猪的一种重要的传染性疾病，是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性猪传染性疾病。猪瘟病毒属于黄病毒科，瘟病毒属，其基因为RNA。其主要致病机理是致小血管壁的变性，从而导致内脏器官多发性出血梗塞和坏死，以出血和发热为主，呈急性或慢性经过，每年给养猪业造成巨大的经济损失。从50年代初，周泰冲等研制出了猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株，在我国猪瘟得到了很好的控制。但是近年来随着养殖规模的不断扩大，猪瘟的流行已发生了明显的变化，典型猪瘟已不多见，非典型猪瘟(或温和型猪瘟)普遍流行。     

我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异

采用 RT-PCR方法 ,从我国 1 0个省、市、自治区收集的 2 3个猪瘟病毒 ( CSFV)流行毒株中 ,扩增了CSFV E2基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定 ,通过计算机分析构建了系统发生树 ,并确定了它们间的遗传相关性。结果表明 ,2 3个流行毒株中的 1 8株属基因 群 ,占 78.2 6%;另外 5个流行株与传统石门强毒、兔化弱毒株属基因 群 ,占 2 1 .74 %。两群间测序区的核酸同源性只有 78.90 %。此外 ,根据序列差异程度 ,将基因 群流行株分为 3个亚群 ,各基因群 CSFV在地域分布上未发现有明显的特征性。本研究初步揭示了我国较大范围内流行的 CSFV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异 ,以及我国猪瘟病毒流行株在地域分布上的多样性     

Vaccination of Pigs Against Hog Cholera (Classical Swine Fever) With a Detergent Split Vaccine

Four pigs were inoculated subcutaneously with a detergent (triton X 100) split hog cholera virus in Freund’s incomplete adjuvant. Four other pigs were in the same way inoculated with a detergent split bovine viral diarrhoea virus, also in Freund’s incomplete adjuvant. In the experiment were used 3 control pigs. The vaccinations were repeated after 3 weeks. All pigs were challenged with highly virulent hog cholera virus (Tübingen) 12 weeks after primary inoculations. Signs of hog cholera were only noted in the control pigs.This introductory experiment was succeeded by a larger experiment with subcutaneous inoculations of: 10 pigs with detergent split hog cholera virus in Freund’s incomplete adjuvant, 10 pigs with detergent split hog cholera virus in a saponin (Quil A) solution, 10 pigs with detergent split bovine viral diarrhoea virus in Freund’s incomplete adjuvant, 10 pigs with detergent split bovine viral diarrhoea virus in the Quil A solution plus 5 control pigs. The vaccinations were repeated after 3 weeks, and finally all pigs were challenged 9 weeks later with the highly virulent hog cholera virus strain.With the exception of 1 animal which died accidentally, all animals survived in the groups inoculated with the Quil A vaccines and in the group inoculated with the detergent split hog cholera virus/oil adjuvant vaccine. In the group inoculated with the detergent split bovine viral diarrhoea virus/oil adjuvant vaccine, some of the pigs died of hog cholera.     

猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古分离野毒株(NMW)E2(gp55)基因的克隆与序列分析

采用反转录PCR（RT—PcR）和套式PCR（nested-PCR）扩增了猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古野毒株的E2（gp55）基因，片段长约1200bp，将PCR产物与PMD-18-T载体相连接并克隆后，经酶切、PCR鉴定后进行序列测定和分析，结果显示二者的核苷酸同源性为89．7％，这一结果表明内蒙古近期流行的猪瘟野毒株与目前使用的疫苗株在E2基因上存在一定的差异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染抑制猪瘟疫苗的免疫应答

对20日龄SPF猪和20日龄猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）血清阳性猪，人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北京分离株（BJ－4）后48h接种猪瘟疫苗，利用ELISA方法检测仔猪针对PRRSV和猪瘟疫苗的体液免疫，利用MTS法检测仔猪外周血单核细胞对有丝分裂原ConA的刺激反应。结果表明，不论是SPF仔猪还是带有PRRSV抗体的仔猪，在鼻内接种PRRSV后48h接种猪瘟疫苗，其对猪瘟疫苗的抗体反应显著低于对照组，对有丝分裂原ConA的刺激反应也下降。由此说明，PRRSV感染使仔猪对猪瘟疫苗的免疫应答受到抑制。     

猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗的中试生产及区域试验

按照拟定的猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗制造工艺在辽宁益康生物药品厂进行了5批该疫苗的中试生产,计15万头份,检验全部合格.在北京、河北等地选择9个猪场进行区域试验,共免疫3个品种约3万余头猪,均安全、未显现任何不良反应,跟踪观察,免疫过的猪未发生猪瘟,表明该疫苗安全有效.     

用MAB-ELISA对仔猪母源猪瘟抗体的试验

用猪瘟兔化弱毒苗4头份免疫后的母猪3头，分别于分娩后定期日龄采血分离24头份血清样品，初生仔猪16头，分别于出生后定期日龄前腔静脉采血分离128头份血清样品，用单抗酶联免疫吸附试验检测血清猪瘟抗体滴度，结果表明，母猪猪瘟抗体效价持续较高，达100％保护率，哺乳前仔猪抗体效价为0，吃初乳后抗体水平不断提高，但抗体总体效价较低，仅有57．89％的保护率；仔猪20日龄前平源抗体水平差异较大，与母猪抗体水平不呈正相关。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量

为建立一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5′端非编码区设计1对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其他猪源病毒发生非特异性反应。应用实时荧光定量RT-PCR法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明,102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在107~102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感性、特异性、重复性好等优点,可望取代传统的兔热法用于猪瘟疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新的有效工具。     

实验室人工感染诱发猪瘟野毒垂直传播

利用2头人工感染中等毒力猪瘟野毒耐过猪进行配种,诱发了猪瘟野毒垂直传播.带毒母猪于带毒后171 d产下9头仔猪,其中3头为死胎,6头为木乃伊.直接免疫荧光抗体试验和RT-PCR检测,9头均为阳性.测序结果表明,3头测序仔猪中,2头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的一致;另1头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的同源性高于与母猪所接种病毒的同源性.母猪在与公猪配种前后,其所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列发生了变化,配种后与公猪所分离病毒的一致,说明猪瘟病毒在猪体内的繁殖存在一定的优势选择现象.     

猪瘟免疫程序的研究

采用HRP—SPA—ELISA方法,在同一猪场相同的饲养条件下,对5种常用猪瘟免疫程序免疫后不同时间的猪瘟免疫抗体水平进行了研究.结果表明:超前免疫,1月龄1次免疫,2月龄1次免疫和1月龄、2月龄2次免疫猪均有良好的免疫应答,90日龄检测80倍稀释血清的ELISA OD值均在0.30以上(0.31～0.48),120～240日龄血清ELISA抗体一直保持在较高水乎(OD值0.42～0.66);而超前、2月龄2次免疫猪的免疫应答明显低于前4种免疫程序,120日龄时的ELISA OD值仅为0.25,此后上升也较缓慢,至240日龄时才达0.43.根据本研究结果,综合过去的报道,建议在“猪瘟控制地区”采用1月龄1次免疫或2月龄1次免疫,在“猪瘟未控制地区”采用1月龄1次免疫或超前免疫.     

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对12批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒，以RT-PCR获得了E2基因的主要编码区的大约250bp大小的节片，在DNAstar上对这些节片的211pb进行了测序，观察到这些节片的编码序列高度同源性，其核苷酸序列和氨基酸序列有98.1%-100%相同，其中9批完全一致，结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。