猪源乳酸菌分子生物学鉴定及黏附性特征

采用16S rDNA序列分析法对实验室分离得到的3株乳酸菌(标号分别为H菌、031菌和HN菌)进行分类鉴定.结果显示H菌、031菌和HN菌16S rDNA序列相似性为99％的对应菌株分别是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02作为体外模型,通过革兰氏染色法观察,结果表明:H菌在4h、8h、12h、16h、20h、24h和28h对猪小肠上皮细胞的黏附性不同,其中以孵育16h和20h的菌黏附性最好,处于该菌生长稳定期,单个细胞黏附细菌个数分别达到14.61±7.23和15.20±4.18个.     

黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及体外抑菌活性研究

采用正交提取法提取黄芩中黄芩苷,HPLC法检测其含量,并测定提取物对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌两种供试菌的体外最小抑菌浓度（MIC）。结果表明,最佳正交提取工艺为A2B2C3,即乙醇浓度70％、体积100mL、冷浸36h,提取物对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为0．50mg／mL和0．20mg／mL。     

泥胡菜水提物的体外抗菌作用试验

采用试管预试法和圆形滤纸层析法对泥胡菜的化学成分进行分析,结果表明,泥胡菜含有生物碱、有机酸、蛋白质、多肽、氨基酸、酚性成分、鞣质、糖类等化学成分;用纸片法和试管法对泥胡菜水提取液进行体外抗菌作用试验,结果表明,泥胡菜水提取液对金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌都有较强的抗菌作用.抑菌圈直径分别为19.66 mm±0.53 mm、13.45 mm±0.21 mm、15.84 mm±1.23 mm、12.78 mm±0.34 mm、12.43 mm±0.52 mm;泥胡菜水提取液对金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.063、0.125、0.25、0.125、0.25 g/mL.最低杀菌浓度(MBC)分别为0.063、0.25、0.5、0.125、0.25 g/mL.     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

大肠埃希氏菌F18菌毛结构蛋白与黏附特性的关系

利用已表达的F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位的融合蛋白（GST-FedA／ab、GST-Fe-dA／ac、GST-FedE、（；STFed-F／ab、GST-FedF／ac）分组肌肉注射健康家兔，制备抗FedA／ab、Fe-dA／ac、FedE、FedF／ab、FedF／ac多价血清。结果表明，所制备的5种抗Fed多价血清均能凝集F18ab^＋。大肠埃希氏菌107／86株和F18ac^＋大肠埃希氏菌8813株。利用抗大肠埃希氏菌F18菌毛主要结构亚单位FedA特异抗体和次要结构亚单位FedE、FedF特异抗体，研究了F18菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性。结果发现，FedA抗体和FedE抗体单独和合并均不能抑制F18^＋菌与小肠上皮细胞的黏附，而单用抗FedF抗体即能明显抑制F18^＋大肠埃希氏菌与小肠上皮细胞的黏附，表明FedA和FedE与F18菌毛的黏附不具相关性，而FedF才是F18菌毛的黏附性结构亚单位。     

苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌体外抑制试验

为了确定苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌的体外抑菌活性,选取奶牛子宫内膜炎致病菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为供试菌株,采用纸片扩散法、牛津杯法对2种生物碱进行了药敏试验,采用液体倍比稀释法测定了其最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫中分离的耐药性大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)均有一定的抑制作用。苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL,氧化苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为25mg/mL和50mg/mL。     

茜草素的抗菌活性与药效试验

用化学合成的茜草素做了体外抑菌试验、体内抗菌活性试验、人工感染猪多杀巴氏杆菌疗效试验、急性毒性试验及临床治疗试验.结果表明,茜草素在体外对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、沙门菌和克雷伯氏菌等均有显著的抑制作用,对后4种病原菌的抑制作用超过了六茜素.在小白鼠体内对大肠埃希氏菌也有非常显著的抗菌作用.对人工感染多杀巴氏杆菌的患病仔猪有显著的治疗作用.小白鼠腹腔注射茜草素的LD50为336 mg/kg.茜草素对临床型乳牛乳腺炎的治愈率为87.5%,总有效率为100%.     

蠔猪刺和乌樟水提物对禽源大肠埃希菌和沙门菌抑菌作用研究

为了解察蠔猪刺、乌樟水提物的体外抗菌活性及其与常用抗生素的联合抑菌效果.选择大肠埃希菌ATCC25922标准菌株及临床采样分离纯化的大肠埃希菌和沙门菌为检测菌,采用微量内汤稀释法和棋盘稀释法分别测定蠓猪刺和乌樟水提物的最小抑菌浓度(MIC)及其与常用抗生素的部分抑菌浓度指数(FIC).结果表明,蠔猪刺和乌樟与常用抗菌药物合用表现出协同或相加效应.     

杠板归化学成分分析及抗菌效果研究

采用试管预试法和圆形滤纸层析法,分析了杠板归的化学成分.结果表明,杠板归含有酚类、有机酸、生物碱、氨基酸、鞣质、黄酮、蒽醌、甙类、糖类、植物甾醇及三萜类等化学成分.用纸片法和试管法对杠板归水提取液进行了体外抗茵作用试验.结果表明,杠板归水提取液对金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希茵等兽医临床常见病原微生物都有较强的抗菌作用,抑茵圈直径分别为21.86 mm±0.83mm、13.28 mm±0.46 mm、18.46 mm±0.73 mm、15.67 mm±0.31 mm和17.69 mm±0.56 mm;杠板归水提取液对金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希茵的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.031、0.25、0.063、0.125、0.063 g/mL.最低杀菌浓度(MBC)分别为0.031、0.5、0.063、0.25、0.125 g/mL.     

黄芪多糖对奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌作用

采用水提醇治法提取黄芪多糖,并应用琼脂扩散法研究了黄芪多糖对几种奶牛乳房炎主要致病菌的抑制效果。结果表明,10 mg/mL的黄芪多糖对3种细菌都有一定的抑制效果,其中对大肠埃希菌的抑制作用最强,抑菌圈达11.05 mm±0.31 mm,对链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为8.50 mm±0.71 mm和9.32 mm±0.21 mm。3种细菌的最小抑菌浓度不同,对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为6.6 mg/mL,而对金黄色葡萄球菌和链球菌则为10.0 mg/mL。     

乳酸菌和大肠杆菌对固定化犬肠道黏蛋白模型的黏附性

采用固定黏蛋白模型,结合细菌同位素γ-32P-ATP标记法,探讨犬源肠球菌E01和E16、犬源大肠杆菌DE、鸡源德氏乳酸杆菌德氏亚种N11及猪源约氏乳杆菌JJB3和致病性大肠杆菌ATCC25922和CVCC2060对本地犬各肠段黏蛋白的黏附能力;肠球菌E16和大肠杆菌DE各自的黏附机制;2株犬源肠球菌以3种作用方式（排斥、竞争、取代）对2株致病性大肠杆菌的黏附抑制作用。结果表明,各测试菌株在犬各肠段黏蛋白模型上的黏附值均不同;2株犬源肠球菌和1株猪源乳酸菌的黏附性能显著优于犬源大肠杆菌DE和2株致病性大肠杆菌;乳酸肠球菌E16表面的碳水化合物结构和糖蛋白参与了黏附过程,大肠杆菌菌体蛋白在黏附过程中发挥一定作用;乳酸肠球菌的黏附受体对高碘酸钠和胰蛋白酶处理不敏感,大肠杆菌DE的黏附受体具有碳水化合物结构,可能为糖蛋白类物质;在肠球菌与病源菌的3种作用方式中,取代和排斥方式对病原菌黏附抑制效果较好。这表明2株犬源肠球菌具开发为益生菌的潜力。     

Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal Enterococcus faecium colonization?

Selected probiotic lactic acid bacteria (LAB) have been shown to elicit positive health effects particularly in humans. Competitive exclusion of pathogens is one of the most important beneficial health claims of probiotic bacteria. The effect of probiotic LAB on competitive exclusion of pathogens has been demonstrated in humans, chicken and pigs. In this study we evaluated the ability of certain LAB strains (Lactobacillus rhamnosus GG, Bifidobacterium lactis Bb12, Lactobacillus pentosus UK1A, L. pentosus SK2A, Enterococcus faecium M74 and E. faecium SF273) to inhibit the adhesion of selected canine and zoonotic pathogens (Staphylococcus intermedius, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Clostridium perfringens and Campylobacter jejuni) to immobilised mucus isolated from canine jejunal chyme in vitro. Adhesion of C. perfringens was reduced significantly by all tested LAB strains, between 53.7 and 79.1% of the control without LAB, the LAB of canine origin yielding the best reduction. The adhesion of S. Typhimurium and S. intermedius were not significantly altered by any of the LAB included in the study. Both enterococci tested significantly enhanced the adhesion of C. jejuni, to 134.6 and 205.5% of the control without LAB. E. faecium may thus favor the adhesion and colonization of C. jejuni in the dog's intestine, making it a potential carrier and possibly a source for human infection. Enhanced C. jejuni adhesion is a new potential risk factor of enterococci. Our results further emphasize the importance of safety guidelines to be established for the probiotics intended for animal use.     

几株益生乳酸菌对Caco-2细胞的黏附及其对致病菌黏附的影响

以Caco-2细胞作为体外模型研究几株乳酸菌的黏附性能及其对大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌的黏附抑制性能。采用荧光标记法评价这几株乳酸菌的黏附性能,并通过竞争、排斥和置换试验检测其对上述2株病原菌黏附的抑制作用。结果表明:1)除了乳酸乳球菌外,其他乳酸菌对Caco-2细胞的黏附率均高于这2株病原菌,且黏附率为乳杆菌(Lactobacillus)>肠球菌>致病菌>乳球菌。2)来源于健康鸡肠道的乳杆菌与分离于人肠道的鼠李糖乳杆菌(Lacto-bacillus rhamnosus)和食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)的黏附率接近。3)大部分乳酸菌菌株能通过置换作用抑制大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌的黏附。结果提示,这几株乳酸菌对肠上皮细胞均有较高的黏附率,尤其是乳杆菌,且它们的黏附有菌属特异性。乳酸菌抑制上述2种病原菌的黏附主要通过置换方式,但没有菌属特异性,且与其自身的黏附力也没有必然的联系。     

Putative probiotic Lactobacillus spp. from porcine gastrointestinal tract inhibit transmissible gastroenteritis coronavirus and enteric bacterial pathogens

A total of 310 bacterial strains isolated from the porcine gastrointestinal tract were tested for their activity against transmissible gastroenteritis (TGE) coronavirus and other enteric pathogens. Based on activity, the strains Probio-38 and Probio-37 were selected as potential probiotics and identified as Lactobacillus plantarum Probio-38 and Lactobacillus salivarius Probio-37 respectively by 16S rRNA gene sequencing. Supernatants of these strains inhibited TGE coronavirus in vitro in ST cells, without any cytopathic effect even after 72 h of incubation. Both the strains exhibited high survival in synthetic gastric juice. The strains were resistant to 5% porcine bile and exhibited antimicrobial activity against all the 13 enteric bacterial pathogens tested. These strains also exhibited resistance to most of the antibiotics analyzed. The inhibition of transmissible gastroenteritis coronavirus and enteric bacterial pathogens as well as the bile tolerance, high survival in gastric juice, and the antibiotic resistance indicate that the two isolated bacterial strains are ideal probiotic candidates for animal application after proper in vivo experiments.     

鸡源嗜酸乳扞菌的筛选

试验从健康雏鸡嗉囊、小肠、盲肠等部位分离到12株乳酸菌,通过试验筛选出了1株乳酸菌,初步鉴定为嗜酸乳杆菌,并对其耐酸、抑菌生物学特性进行初步研究。结果表明,嗜酸乳杆菌具有强耐酸性和黏附性,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用。     

Testing two Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus strains for their suitability as a lipoid probiotic

Two strains of lactobacilli (Lactobacillus acidophilus T-135 and Lactobacillus plantarum 4/97) were selected in order to study their inhibitory properties against frequent udder pathogens (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Salmonella enteritidis and Bacillus pumilus), their production of organic acids as well as their ability to survive on the teat skin, the teat duct mucosa and in a lipoid emulsion. Both strains inhibited the tested pathogenic microbes and survived on the investigated surfaces and in an emulsion for more than 6 hours and 11 days, respectively.     

乳酸杆菌对病原菌粘附肉鸡肠粘液的影响

研究嗜酸乳杆菌、禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC 25922、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肉鸡不同肠段粘液糖蛋白的粘附性能,探讨嗜酸乳杆菌对四种病原菌的粘附排斥作用.结果表明,在不同的肠道部位,嗜酸乳杆菌、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力不同,而禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC 25922在各肠段粘液上的粘附性能相近;在相同的肠道部位,所试菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力有差异,其中嗜酸乳杆菌的粘附作用最强;嗜酸乳杆菌对所试病原菌均有不同程度的粘附排斥作用,其中对鸡白痢沙门氏菌的粘附排斥较强,而对大肠杆菌ATCC25922的则较弱.     

健康奶牛子宫颈乳酸菌筛选方法的建立及其抑菌活性分析

为筛选用于防制奶牛子宫炎的乳酸菌菌株,本试验选取产后30~50 d的健康奶牛,采集子宫颈口处分泌物,利用MRS选择性培养基进行乳酸菌初步筛选。纯化后的菌株进行革兰氏染色镜检,将具有乳酸球菌或乳酸杆菌典型形态的疑似菌株进行针对性生化鉴定。提取分离菌株的基因组DNA,扩增其16S rDNA全序列并测序,将所得序列与NCBI数据库中的相应序列进行同源性比对分析。采用琼脂扩散法检测分离菌株对致病性金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性,并检测分离菌株对山羊上皮细胞的黏附活性。结果显示,经染色镜检、生化鉴定和16S rDNA测序分析,得到13株乳酸菌,其中5株具有较强抑菌活性,6株具有较强黏附上皮细胞的能力,7、12和23号3株兼有良好的抑菌活性和黏附上皮细胞能力。综上,本试验建立了健康奶牛子宫颈中乳酸菌的筛选方法,得到3株具有良好益生特性的乳酸菌,为制备微生态制剂提供了基础材料,对防制奶牛子宫炎具有重要意义。     

某新建大型奶牛场临床乳房炎病原菌分离及发病规律

对我国南方地区某新建大型奶牛场2010年10月至2012年7月间头胎及二胎共2006头荷斯坦牛临床乳房炎发病情况进行调查,结合病原菌感染类型结果,用x^2检验分析不同胎次临床乳房炎发病次数和发病率及不同致病菌导致的临床乳房炎在不同季节和泌乳阶段发病率的差异。结果表明,该牛场一胎和二胎奶牛临床乳房炎发病率分别为11．81％和9．02％（按头数算）,但二胎牛多次发生临床乳房炎的比例较大。一胎奶牛仅发现大肠杆菌和葡萄球菌单独感染及葡萄球菌一大肠杆菌混合感染3种病原菌组成类型,二胎奶牛比头胎牛增加了金黄色葡萄球菌、链球菌、酵母菌和链球菌一葡萄球菌混合感染4种类型。致病菌类型以大肠杆菌和葡萄球菌单独感染为主,一、二胎奶牛均占总发病数85％以上;季节和泌乳阶段对一、二胎奶牛临床乳房炎发病率具有显著影响（P〈0．05）,一胎牛秋季发病率最高,而春季发病率最低,而二胎牛冬季发病率最高（33．33％）,秋季最低（16．88％）;2个胎次奶牛泌乳早期临床乳房炎发病率明显高于其他阶段。大肠杆菌和葡萄球菌在整个泌乳期均可发生,酵母菌主要出现在二胎牛泌乳中期,平均感染时间分别为（148．75±69．60）d,而金黄色葡萄球菌和链球菌主要发生在二胎牛泌乳后期,平均感染时间分别为（213．60±55．88）和（234．43±42．35）d。结果对该地区同类型奶牛场临床乳房炎防控有重要的参考价值。     

几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

为比较几种商用益生芽孢的菌株特性，为芽孢杆菌的选育提供理论基础，本试验收集整理了15种药用（Y1~Y6）和饲用益生芽孢杆菌（S7~S15）产品，对其芽孢杆菌进行分离鉴定，分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶等酶活特性，抗菌活性，耐酸和耐0.3%胆盐稳定性，抗生素敏感性，耗氧及生长速率测试等方面对芽孢杆菌特性进行了比较研究。结果显示，分离的15株芽孢杆菌均能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，但不同菌株产酶能力差异较大，S9菌株表现出较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力；所有分离的芽孢杆菌均能对金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌产生显著抑制活性，但只有7株芽孢杆菌（Y2、Y6、S7、S9、S10、S11、S12）可对大肠杆菌产生抑制作用，尤其是S9菌株综合抗菌能力最强。S9、Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力，S9、Y2菌株在0.3%胆盐环境中存活率超过90%。15株芽孢杆菌中有3株饲用来源菌株（S10、S12、S13）表现出对红霉素的耐受，S10菌株对四环素耐受。此外，S9菌株具有较快的耗氧速率和生长速率。上述结果表明，S9菌株（解淀粉芽孢杆菌）的益生特性更为优良，本试验结果可为芽孢杆菌益生菌的选育及活性评价提供参考依据。