ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性

设计了1对特异性引物,从疑似PMWS（断乳仔猪多系统衰竭综合征）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-B）。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子（命名为PCV2-B）。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3＋和CD4＋整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。     

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD.序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%～100%.用Nco Ⅰ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序.用Sac Ⅱ酶切pTS-PCV2-CD-C.回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C.PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCVl阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒.试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因.     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒（PCV2）的核酸序列，设计了1对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析，结果表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92．0％～93．3％，推导氨基酸序列的同源性为82．9％～84．6％。重组质粒pMD18-T-ORF2经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES。成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

一种克隆载体重组质粒pMD18-T Simple-PCV2的构建

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)的全基因组变异特性,试验设计了1对特异性引物,并从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2),经酶切鉴定、PCR鉴定和序列测定分析的阳性重组质粒被证明含有长为1 767 bp的PCV2片段,同时通过Blast与GenBank中国内外的部分PCV2毒株进行同源性比较分析。结果表明:与国内外12个毒株间的同源性介于95.0%～100%之间,与国内的河北株(HB株)亲缘关系最近,同源性高达100%;与澳大利亚株(AUT2株)亲缘关系最远,同源性为95.0%。说明来源不同国家和地区的猪圆环病毒2型毒株存在地域性差异。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究

15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组）,分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法,分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA,发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明;A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变,其中B组病变较严重,证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比,A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低,而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升,高于B组和C组,表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱,并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫,具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型（PCV1）ORF2基因序列，设计了1对引物，应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2，并对其进行了测序与分析。结果表明：所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99．4％，二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97．3％～99．9％，与PCV2 ORF2基因的同源性为67．9％～68．4％，二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明，PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因（939 bp）克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达

参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。     

Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Pseudorabies (PR) is also an important infectious disease in swine and sometimes co-infect with PCV2. An attenuated pseudorabies virus (PRV) has been successfully used as a vector for live viral vaccines. In this study, a recombinant PRV expressing ORF1-ORF2 fusion protein of PCV2 was constructed and its immunogenicity was tested in mice and pigs. The ORF1 and partial ORF2 gene of PCV2 Yu-A strain were amplified by PCR and inserted into a transfer vector. The recombinant transfer plasmid was co-transfected with the EcoRI digested genome of vector virus (PRV TK-/gE-/LacZ+) into IBRS-2 cells. The recombinant pseudorabies virus PRV-PCV2 was purified by plaque purification and identified by PCR and Southern blotting. Expression of the ORF1-ORF2 fusion protein by the recombinant PRV-PCV2 virus was demonstrated by Western blotting analysis. The growth properties of the recombinant virus in cells were similar to that of the parent vector virus. In animal experiments, PRV-PCV2 elicited strong anti-PRV and anti-PCV2 antibodies in Balb/c mice as indicated by PRV-neutralizing assay, anti-PCV2 ELISA and PCV2 specific lymphocyte proliferation assay, respectively. And PRV-PCV2 immunization protected mice against a lethal challenge of a virulent PRV Ea strain. In pigs, PRV-PCV2 elicited significant immune response towards PRV and PCV2 as indicated by PRV-ELISA, PRV neutralizing assay and PCV2 specific lymphocyte proliferation assay, respectively. This is a first step toward the development of a potential candidate divalent vaccine against PRV and PCV2 infections.     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的ORF2基因与T细胞表位（T cell epitope,TCE）基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头（Gly₄Ser）₃为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子（Gly₄Ser）₃进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（内含pAdEasy-1骨架质粒）进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为10^12.3 TCID₅₀/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorecent assay,IFA）结果表明融合蛋白得到正确表达。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2／猪白介素-2（PoIL-2）嵌合重组表达质粒（rpcDNA3．1／PCV2-linke PoIL-2）在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3．1／PCV2-linker-PolL2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性EI。ISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3．1／PCV2qinker-PolL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3．1／oRF2质粒;在rpcD—NA3．1／PCV2-linkePolL-2质粒或rpcDNA3．I／ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3．1／PCV2-linkerPoIL-2质粒为下-步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

猪圆环病毒2型河北株的全基因组克隆与系统进化分析

应用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出PCV-2全基因组（1767bp）,将此基因片段克隆入pMD20-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV2并对其进行序列测定,然后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明,PCV-2分离毒株与参考株的全基N组同源性介于94％～98．4％之间,ORF1的同源性介于97．0％～98．8％,ORF2的同源性略低,介于91．9％～98．4％之间。该毒株与荷兰株、广西株和上海株等在一个进化分支上。本研究有助于监测PCV-2的疫源和进化关系,为进一步深入研究病毒基因功能奠定一定基础。     

Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), which is an important economical disease affecting the pig industry worldwide. In order to develop an effective vaccine for PMWS, a recombinant pseudorabies virus (PRV) was generated and tested in piglets in this study. The PCV2 open reading frame 2 (ORF2) gene was inserted into pIECMV plasmid and co-transfected with PRV Tk-/gE-/LacZ+ genome into IBRS-2 cells to generate a recombinant Tk-/gE-/ORF2(+) virus. The expression of PCV2 ORF2 gene in the recombinant virus was confirmed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay (IFA). Four-week-old piglets were immunized by the recombinant virus, and the immunogenicity of PRV Tk-/gE-/ORF2(+) was tested by PRV-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), PRV neutralizing assay, ORF2-ELISA and ORF2 specific lymphocyte proliferation response. PRV Tk-/gE-/ORF2(+) elicited significant humoral immune responses to both PRV and PCV2, and the PCV2-specific lymphocyte proliferation response could be detected on day 49 of this experiment. These findings suggest that the recombinant PRV Tk-/gE-/ORF2(+) may be a potential vaccine against both PCV2 and PRV.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF3基因的克隆及变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF3基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP3进行序列测定与分析。应用DNA Star软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株的ORF3基因进行序列比较,并绘制系统进化树。这为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅣ部分基因片段的表达及纯化

参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的App DNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3′端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD—ApxⅣ进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建了重组表达质粒pET—ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET—ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39．5KOa。利用HiTrap FF crude columns将表达的蛋白进行了纯化。