牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体。经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600。Western-blot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具。     

牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600.Westernblot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具.     

奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

本试验旨在制备高纯度和特异性的奶牛αs-酪蛋白多克隆抗体,为鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白提供试验材料。选用4只健康新西兰大白兔,每2周免疫1次奶牛αs-酪蛋白,待血清达到抗体效价后,对兔进行颈动脉放血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。结果表明,经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高的抗体,同时可以特异性结合奶牛αs-酪蛋白。本试验制得的抗体可以用于鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白,为进一步研究奶牛αs-酪蛋白合成的调控提供了有效的科研材料。     

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。     

人参皂苷Re多克隆抗体的制备

为了制备半抗原人参皂苷Re的特异性多克隆抗体,用过碘酸钠法构建了Re和牛血清白蛋白（BSA）的偶联物作为抗原,分5次免疫新西兰大白兔、取免疫前的新西兰大白兔血清作为空白对照,第5次免疫后采取血清,通过酶联免疫法（ELISA）鉴定血清中Re多克隆抗体的效价,再用竞争性抑制法检测抗体的灵敏性和特异性。,结果表明,抗原Re—BSA偶联物制备成功,第5次免疫后,抗体的效价达到1：40960,与其他人参皂苷交叉反应率低于2％,特异性强,可用于人参皂苷Re的检测。     

塞内卡病毒多克隆抗体的制备及其在免疫组织化学中的初步应用

为了制备纯度高、特异性强的塞内卡病毒(SVA)多克隆抗体并研究其在免疫组织化学(IHC)中的应用，本试验用甲醛溶液灭活SVA,将其与矿物油佐剂充分混合乳化后，接种兔制备多克隆抗体并测定中和抗体效价，经Protein A亲和层析介质纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度，用斑点杂交法(Dot blot)鉴定抗体特异性；以该抗体作为一抗，应用IHC技术检测SVA感染猪的蹄部组织切片中抗原的表达情况。结果显示，制备的SVA多克隆抗体中和抗体效价为1∶1 024,纯化后的抗体经SDS-PAGE鉴定仅有分子量约55 kDa和25 kDa两条目的蛋白条带；Dot blot结果显示，该抗体特异性强，最低检测浓度为0.15μg/mL;IHC结果显示，该抗体在1∶500稀释时能够检测到组织切片中抗原的表达。结果表明，本试验制备的SVA多克隆抗体符合IHC技术要求，可为下一步SVA致病机理研究提供重要的试验材料。     

鸭MHCⅡβ基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT—PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1：100倍稀释后用于Westernblot分析。结果表明：克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92％;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95％。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验（ELISA）与免疫印迹法（Westernblot）证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。     

抗家禽Beta-连环蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备能结合家禽Beta-连环蛋白(β-catenin)的特异性多克隆抗体并进行生物学鉴定。根据GenBank中公布的β-catenin序列,经生物软件比对分析筛选一段抗原性好的序列合成多肽,将多肽与KLH偶联免疫新西兰兔。免疫血清经多肽亲和层析后制得纯化的多克隆抗体,并利用Western blot、间接免疫荧光、免疫组化方法对多克隆抗体进行生物学鉴定。研究表明制备的抗家禽β-catenin多克隆抗体可有效检测家禽细胞中天然的β-catenin蛋白。     

山羊β雌激素受体多克隆抗体的制备及免疫组化方法的建立

本研究旨在克隆济宁青山羊雌激素受体β(ERβ)基因,进行原核表达,制备多克隆抗体,建立免疫组化分析方法,检测济宁青山羊卵巢和子宫内ERβ分布。根据GenBank发布的绵羊ERβ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR方法从济宁青山羊卵巢组织中扩增ERβ部分基因。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体pET32a(+),构建重组表达载体pET32a(+)-ERβ,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定;经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并检测抗体效价及特异性;使用该抗体检测济宁青山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERβ分布。结果表明,成功扩增出ERβ部分基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量约为53ku的融合蛋白;Western blotting证明该融合蛋白能与兔抗人的ERβ多克隆抗体特异性反应。制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶213,以此抗体代替购置的标准兔抗人ERβ抗体,进行Western blotting反应,特异性良好;使用该抗体建立免疫组化方法检测结果表明济宁青山羊卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞存在ERβ的分布。本研究获得特异性兔抗山羊ERβ多克隆抗体,使用该抗体建立免疫组化方法首次报道了济宁青山羊卵巢和子宫ERβ的分布表达,为进一步研究β雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。     

磺胺甲噁唑抗原合成及其抗体的制备

采用重氮化法将磺胺甲噁唑(SMZ)与人血清白蛋白偶联形成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描和高效液相色谱分析偶联物,免疫抗原的偶联率为19∶1,改良辛酸-饱和硫酸铵纯化抗体,多克隆抗体效价达1∶105,间接酶联免疫吸附试验建立的SMZ检测的线性范围在0.1ng/mL~10μg/mL之间,50%抑制率检测限为22.53ng/mL,抗体与磺胺甲噁唑交叉反应率为100%,与其他7种磺胺药交叉反应率很低。表明制备的磺胺甲噁唑多克隆抗体具有很高的特异性,可用于SMZ在动物性产品中残留的检测。     

氨苯磺胺多克隆抗体的制备

采用重氮化法将氨苯磺胺与人血清白蛋白偶联形成免疫原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描分析，免疫原中药物分子与蛋白质分子的偶联比为32：1，改良辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体，多克隆抗体效价达1：10^5，间接ELISA建立的氨苯磺胺检测的线性范围为1ng／mL～100μ/mL，70％抑制率可检测最低浓度为0．09μ/mL，以抗体与氨苯磺胺的反应率为100％，抗体与其他7种磺胺药交叉反应率很低。结果表明，制备的氨苯磺胺多克隆抗体具有很高的特异性，可用于动物性食品中氨苯磺胺残留的检测。     

山羊乳酪蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

制备山羊乳酪蛋白单克隆抗体可以为检测乳品中山羊乳成分提供免疫学检测手段。以山羊酪蛋白免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术,制备特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体,对获得的阳性杂交瘤细胞进行连续传代和反复冻存以测定其稳定性,并对其分泌的单克隆抗体应用ELISA进行抗体特异性分析,对特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体进行抗体亚型鉴定和染色体组型分析。最终,成功的筛选出可以分泌特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,被命名为7H。经染色体组型分析,染色体数目为102条;单克隆抗体7H类别为IGg1,轻链为κ;经连续传代和反复冻存,ELISA检测细胞上清抗体发现其OD450nm值无显著性差异。     

新疆褐牛CD46基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

旨在克隆并表达新疆褐牛CD46基因,制备其多克隆抗体,为进一步研究牛CD46分子生物学功能奠定基础。采用RT-PCR方法从新疆褐牛脾脏中扩增CD46基因全长,进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析,将CD46部分序列亚克隆于pET-28a(+)和pVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-28a-△CD46转化于E.coli Rosetta-gamiB(DE3)感受态细胞,诱导表达截短CD46蛋白。用切胶纯化的His-△CD46融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;采用ELISA测定多克隆抗体的效价;取无内毒素重组质粒pVAX1-△CD46转入BHK-21(仓鼠肾细胞)细胞,表达产物以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测该多克隆抗体的特异性。CD46基因的测序结果表明,部分基因蛋白表达、纯化条带大小与预期一致;制备的抗牛CD46多克隆抗体效价高于1∶128 000,并具有良好的特异性。     

牛抵抗素多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组牛抵抗素蛋白免疫健康家兔,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化、效价测定、特异性检测,初步建立了检测牛抵抗素的间接ELISA方法。     

四环素多克隆抗体的制备、鉴定及ELISA检测

采用戊二醛交联法和混合酸酐法制备了四环素-BSA完全抗原,分别将两种不同偶联法制备的四环素-BSA完全抗原按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,酶联免疫吸附法鉴定出多抗中含有四环素的特异性抗体,特异性抗体效价最高达1:320000,抑制率为50%(IC50)时的四环素浓度为92.6μg/mL,四环素的最低检测限为6.25μg/mL,四环素和金霉素的交叉反应率达到78%,该方法灵敏度高,为试纸条法快速检测四环素类的残留奠定了基础。     

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。     

牛整合素β7亚基片段的表达及多抗制备

为制备牛整合素β7亚基片段的多克隆抗体,根据GenBank中牛整合素β7基因序列,合成了β7亚基 288 bp(140-427 bp）的cDNA片段,通过DNA重组法构建表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。表达产物经Western blotting鉴定,结果证实成功表达了分子质量约为15 ku的β7蛋白。超声破碎细菌后,Ni-NTA树脂进行纯化,免疫兔子获得多抗。间接ELISA检测多抗效价为1∶32000,为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定基础。     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。     

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列（登录号：NC_001659.2）设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1：128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。     

HA蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定

利用人工合成的多肽制备HA的特异性多克隆抗体,以期用于HA基因的免疫调控机制研究。根据GenBank中报道的皮蝇素A（HyderminA,HA）一级结构信息以及HA抗原生物学信息,获得三段序列特异性较高的多肽,采用9一氟甲氧羰基固相合成法获得多肽,采用HPLC和LC·MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达91．2％、目的多肽分子量为28kD。将多肽与KLH进行偶联,并用其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体。采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别HA特异性条带,其相对分子量为28kD,与预测分子量相符。该抗体的制备为研究HA免疫调控机制提供了有用工具。