消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶+0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P>0.05),但明显高于其他处理组(P<0.01)。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响.试验结果表明,0.25％胰酶+0.20％Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5％与10％浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5％与10％浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P＞0.05),但明显高于其他处理组(P ＜0.01).     

激素和生长因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响

为了研究不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长的影响.试验采用原代外植块培养法,经传代获得乳腺上皮细胞,添加不同浓度的FBS、EGF、胰岛素、氢化可的松和ITS,通过倒置相差显微镜观察,利用血细胞计数板来进行研究.结果表明: 5% 的FBS、10 μg/L的EGF、1 mg/L的胰岛素、0.1 mg/L的氢化可的松、10 mL/L的ITS对乳腺上皮细胞生长的影响较大.说明不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长均具有调控作用,但作用程度不同.     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.     

奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的体外培养与鉴定

为体外培养纯化出稳定的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,试验通过外科手术的方法取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织,分离乳腺腺泡,用组织块法体外培养奶牛乳腺细胞,应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别纯化出来,并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行鉴定。结果表明:纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样生长,并可分泌乳滴,角蛋白-18反应阳性,波形蛋白反应阴性;纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形,呈旋涡状或放射状生长,角蛋白-18反应阴性,波形蛋白反应阳性;经纯化后2种细胞的纯度均可达95%以上,可满足后续试验的要求。     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

荷斯坦奶牛乳腺组织冻存及乳腺上皮细胞原代培养技术改进

为了改进奶牛乳腺上皮细胞原代培养技术和探究乳腺组织冻存方法,选用24月龄无泌乳史荷斯坦奶牛,采用组织块种植法,通过侧置和倒置两种方式,分别从新鲜和冻存(8个月)的乳腺组织中分离培养奶牛乳腺上皮细胞。结果表明,侧置处理能使乳腺细胞爬出时间缩短1~2d,并改善组织块贴壁速度和效果;回收于前次培养后的乳腺组织块再分离培养,贴壁第2天即有乳腺上皮细胞爬出;一步冷冻(-80℃)液氮保存较大奶牛乳腺组织块,冻存液A(FBS∶DMSO∶DMEM/F12=7∶2∶1)冻存的组织块存活率为50%,冻存液B(FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸钠贮存液=10∶7∶2∶1)冻存的组织块存活率为56%。可见,作者建立的侧置处理法和组织块回收法可以用于奶牛乳腺上皮细胞的分离培养,可以缩短组织块种植法实验周期,冻存液中加入缓冲液HEPES/丙酮酸钠后有利于组织块生物活性保持。     

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定

本试验旨在培养功能性奶牛乳腺上皮细胞系,为奶牛泌乳调控和奶牛乳房炎发病机制研究提供功能性的细胞模型。采用组织块细胞培养法来分离纯化并鉴定奶牛乳腺上皮细胞;采用有限稀释法单克隆奶牛乳腺上皮细胞;采用噻唑蓝(MTT)法来分析奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线是否为正常的"S"形;观察细胞角蛋白18免疫荧光来证明所培养的细胞为上皮型;选择培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞进行染色体核型分析。结果表明:1)利用组织块细胞分离法能够成功获得奶牛乳腺上皮细胞并传至20代。2)培养5~6 d成纤维细胞迅速增殖且周围分裂出少量的上皮细胞。培养8 d奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖,形成岛屿状集落,呈单层"鹅卵石"和"铺路石"形态生长。3)奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性。4)培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为60条,具有正常的细胞二倍体核型。综上所述,采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞,但不是永生化细胞。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及超微结构鉴定

通过组织贴块法取部分奶牛乳腺组织进行培养,并通过在培养基中添加适当浓度的营养因子以及控制消化时间将成纤维细胞去除,纯化出原代奶牛乳腺上皮细胞。通过免疫荧光鉴定,形态学观察,扫描电镜和透射电镜检测原代乳腺上皮细胞特性。观察结果显示,本试验分离培养的牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光染色鉴定结果呈阳性。形态学观察及超微结构观察显示,试验所分离的上皮细胞呈鹅卵石样单层聚集,胞内有丰富的线粒体和内质网,细胞状态良好,传至15代以上细胞依然增殖旺盛,因此可以作为研究奶牛乳腺机能的重要工具。     

牛乳腺上皮细胞体外分离和培养

从健康奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过添加两种不同的培养液来分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明,使用组织块接种可以得到大量细胞用于体外培养。在以DMEM/F12为基础的普通培养液中进行乳腺上皮细胞体外培养,原代细胞生长较慢,细胞形态不典型。而添加表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松所组成的完全培养液中,奶牛乳腺上皮细胞生长良好。并通过细胞形态学观察,细胞染色体核型分析,荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白K14,K15。结果表明,分离培养的细胞是牛乳腺上皮细胞。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组（1×104个细胞/mL）、2组（1×105个细胞/mL）、3组（1×106个细胞/mL）、4组（1×107个细胞/mL）4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组（P〈0.01）,贴壁率显著高于其他3组（P〈0.05）;3组细胞凋亡率显著低于其他3组（P〈0.05）;3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）,处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异（P〉0.05）,处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）;处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异（P〈0.01）。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

本试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01);处理4组的贴比率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P0.01)。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其它组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响

应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测王不留行邻苯二甲酸二丁酯对乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响,研究王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞增殖和泌乳性能的影响。试验结果表明,王不留行增乳活性单体成份邻苯二甲酸二丁酯对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和细胞活力提高均显著(P0.05);能显著提高乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达(P0.05),也能提高乳糖的分泌(P0.05,P0.05)。因此,王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯可显著提高乳腺上皮细胞的增殖和泌乳能力。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ、肝细胞生长因子、转化生长因子-β1、干扰素-γ对奶牛乳腺上皮细胞增殖活性的影响

本试验应用组织块培养和差速消化法获取原代奶牛乳腺上皮细胞,免疫荧光鉴定正确后MTT法评价不同浓度的胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、干扰素-γ （interferon-γ,IFN-γ）对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖的影响。结果表明,IGF-Ⅰ、HGF分别在 10～200和0.1～100 ng/mL对乳腺上皮细胞的增殖呈正相关,而TGF-β1（2.5～100 ng/mL）、IFN-γ（5～160 ng/mL）则剂量依赖性地抑制乳腺上皮细胞增殖。提示,IGF-Ⅰ、HGF均能促进奶牛乳腺上皮细胞的体外增殖,该作用在一定浓度范围内有剂量依赖性;TGF-β1、IFN-γ对乳腺上皮细胞的增殖作用出现剂量抑制效应。     

奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响

【目的】探讨奶牛脂肪间充质干细胞（bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,bAD-MSCs）对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响。【方法】使用0、5、25、50、100、200 μmol/L H₂O₂处理奶牛子宫内膜上皮细胞2、4、6、8、12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平来筛选H₂O₂诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的最佳条件。在细胞划痕试验中设立对照组、H₂O₂组、bAD-MSCs共培养组（1∶0.5）、bAD-MSCs共培养组（1∶1）、奶牛乳腺上皮细胞（MACT）共培养组（1∶0.5）和MACT共培养组（1∶1）共6组,分析奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力,并利用Western blotting检测细胞外蛋白调节激酶（Erk）和磷酸化细胞外蛋白调节激酶（pErk）蛋白的表达水平。【结果】MTT试验结果显示,4~12 h内50 μmol/L H₂O₂组细胞存活率为50%~80%,适用于构建氧化应激模型。流式细胞术结果显示,用50 μmol/L H₂O₂刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2 h时,ROS水平显著高于对照组与4、6、8、12 h组（P<0.05）。划痕试验结果显示,与对照组相比,H₂O₂组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著降低（P＜0.05）;与H₂O₂组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著增加（P＜0.05）,MACT共培养组细胞迁移能力均显著降低（P＜0.05）。Western blotting结果显示,与对照组相比,H₂O₂组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与H₂O₂组相比,bAD-MSCs共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中pErk蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）,MACT共培养组细胞中pErk蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。【结论】50 μmol/L H₂O₂处理2 h可成功构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型,bAD-MSCs可促进氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移并参与调控Erk蛋白的表达。     

Research Progress on Primary Culture,Purification and Identification Technique of Bovine Mammary Epithelial Cells

The bovine mammary epithelial cells not only have the function of synthesis and secretion of milk, but also play an important role in innate immunity system of the mammary gland, and there is great significance of them on studying the mechanism of lactation, mastitis pathogenesis and drug screening.Primary cultured bovine mammary gland epithelial cells are suitable for setting up cell model which can be used as the dielectric for physiological, pathological and pharmacological researching, avoiding the difficulties of in vivo test, such as the long cycle, the high cost, the individual difference, etc.The author summarized the latest researches of cell primary culture in vitro, cultivation technology, purification and identification method in order to provide reference for the studies of bovine mammary epithelial cells culture.