羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。     

牛布鲁氏菌病活疫苗(A19-△VirB12株)

<正>由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心和新疆畜牧科学院兽医研究所联合研制的牛布氏菌病活疫苗(A19-△VirB12株)以我国布氏菌病活疫苗(A19株)为亲本株,应用基因同源重组方法,构建含有缺失布鲁氏菌四型分泌系统中VirB12基因的自杀质粒,将该自杀质粒电击转化至A19疫苗株中,筛选发生同源重组而缺失VirB12基因的布鲁氏菌A19-△VirB12。该疫苗     

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对树突状细胞自噬、胞内生存和炎症反应的影响

为探究Ⅳ型分泌系统在布鲁氏菌(Brucella)感染过程中的作用,深入了解布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在疫苗开发中的潜力,本研究以牛种布鲁氏菌A19疫苗株为研究对象,使用A19 VirB启动子缺失株感染小鼠树突状细胞(DCs),通过菌落计数(CFU)评估Ⅳ型分泌系统对布鲁氏菌黏附侵袭及胞内生存的影响,同时对感染的细胞进行RNA和总蛋白的提取,分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬基因Beclin-1的转录和表达情况;收集感染后的细胞上清液,利用ELISA检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和IL-10的分泌水平。黏附侵袭结果显示,布鲁氏菌VirB启动子缺失株与亲本株A19的黏附侵袭水平无显著差异(P>0.05);胞内生存试验发现,感染的4 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株的胞内存活能力显著低于亲本株A19(P<0.05),感染后0、24和48 h极显著低于亲本株A19(P<0.01);实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,感染后4、8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生Beclin-1的水平极显著高于亲本株A19(P<0.01);ELISA结果显示,感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生IL-6的水平显著高于亲本株A19(P<0.05),而在感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞分泌IL-10的水平显著低于亲本株A19(P<0.05),感染24 h时极显著低于亲本株A19(P<0.01)。综上所述,当VirB启动子缺失后,布鲁氏菌对DCs的黏附侵袭能力并未明显改变,但显著降低了布鲁氏菌在DCs内的存活能力,提升了DCs的自噬水平,促进了DCs IL-6的分泌,抑制了IL-10的分泌。本研究初步探究了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在感染DCs过程中的生物学作用,为后续布鲁氏菌疫苗改造研究奠定了理论基础。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对树突状细胞自噬、胞内生存和炎症反应的影响

为探究Ⅳ型分泌系统在布鲁氏菌（Brucella）感染过程中的作用,深入了解布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在疫苗开发中的潜力,本研究以牛种布鲁氏菌A19疫苗株为研究对象,使用A19 VirB启动子缺失株感染小鼠树突状细胞（DCs）,通过菌落计数（CFU）评估Ⅳ型分泌系统对布鲁氏菌黏附侵袭及胞内生存的影响,同时对感染的细胞进行RNA和总蛋白的提取,分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬基因Beclin-1的转录和表达情况;收集感染后的细胞上清液,利用ELISA检测炎症因子白细胞介素-6（IL-6）和IL-10的分泌水平。黏附侵袭结果显示,布鲁氏菌VirB启动子缺失株与亲本株A19的黏附侵袭水平无显著差异（P>0.05）;胞内生存试验发现,感染的4 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株的胞内存活能力显著低于亲本株A19（P<0.05）,感染后0、24和48 h极显著低于亲本株A19（P<0.01）;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,感染后4、8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生Beclin-1的水平极显著高于亲本株A19（P<0.01）;ELISA结果显示,感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生IL-6的水平显著高于亲本株A19（P<0.05）,而在感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞分泌IL-10的水平显著低于亲本株A19（P<0.05）,感染24 h时极显著低于亲本株A19（P<0.01）。综上所述,当VirB启动子缺失后,布鲁氏菌对DCs的黏附侵袭能力并未明显改变,但显著降低了布鲁氏菌在DCs内的存活能力,提升了DCs的自噬水平,促进了DCs IL-6的分泌,抑制了IL-10的分泌。本研究初步探究了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在感染DCs过程中的生物学作用,为后续布鲁氏菌疫苗改造研究奠定了理论基础。     

8株布氏杆菌BCSP31基因的序列分析

参照GenBank中布氏杆菌的全基因组序列，设计一对特异性引物，通过PCR方法，扩增了8株来自3个布氏杆菌种的布氏杆菌表面蛋白31（BCSP31）全基因。PCR产物经克隆和序列分析后发现，该基因非常保守，8株不同菌株间的同源性高于99．3％；进化关系分析显示，5株中国来源的菌株（S2，M5，M111，M28，A387）显示了最近的同源关系，其中2个弱毒菌株S2和M5的BCSP31基因序列100％同源。3株外国来源的菌株（S19，2308，Rev．1）中，S19和2308同源性为100％。Rev．1与其他7株布氏杆菌BCSP31基因均有较大的差异。序列分析结果表明，BCSP31基因序列差异与布氏杆菌的种属和毒力无相关性。     

布鲁氏菌VirB8变异株的构建及其感染力和毒力的测定

作者拟对缺失致病力因子--四型分泌系统中的VirB8基因后布鲁氏菌感染力和毒力的变化进行测定与分析.首先,构建了布鲁氏菌VirB8基因缺失株(△B8B.suis),用缺失株感染巨噬细胞和BALB/c小鼠,再用B.suis强毒攻击BALB/c小鼠并检测脾脏含菌数,观察其在动物体内定居能力、毒力及抗感染保护力.鉴定△B8B.suis为VirB8基因完全缺失株,△B8B.suis感染巨噬细胞6、24和48 h,其CFU分别为49、165和355;△B8B.suis感染BALB/C小鼠的每克脾含菌数为3.6×107(1×108CFU腹腔接种)和5×106(1×109CFU蹊部接种);BALB/c小鼠攻毒试验显示△B8B.suis免疫组每克脾平均含菌数为7.61×102,非免疫对照组为2.98×105.结果表明布鲁氏菌缺失VirB8基囚后,其毒力较亲本株弱,但能在小鼠脾脏定居,为弱毒株;△B8B.suis呈现出作为疫苗的生物学特性,但毒株能否作为疫苗株使用,还需进一步验证.     

牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定

为进一步改良布鲁氏菌(Brucella)的分离和鉴定方法,本研究于2010年～2012年对新疆部分奶牛场进行Brucella病的监测,采用改良Brucella选择添加剂培养分离的方法,从试管凝集试验(SAT)检测阳性的25头奶牛的牛乳样中分离到9株分离菌,经VirB8-PCR方法扩增Brucella的VirB8基因对分离株进行鉴定,结果表明9个分离株均为Brucella。同时采用Brucella分子分型PCR及生物学分型方法进一步対分离株鉴定,结果显示其中7个分离株为牛3型,另外2个分离株为羊3型。本研究为奶牛Brucella病的检疫与防控提供了快速分离及鉴定方法。     

奶牛布鲁氏菌的PCR鉴定

采集内蒙古某地区的可疑感染布鲁氏菌病奶牛的乳样及奶牛流产胎儿的肺、肝、脾等相关病料,分离并培养出11株病原菌,经BCSP31-PCR、VirB8-PCR、多重PCR及AMOS-PCR4种PCR方法鉴定,证实11株病原菌均为布鲁氏菌,并将11株菌定型为牛种5,6,9或3b型.     

布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p0.05),并且均显著高于PBS组(p0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。     

布鲁氏菌omp28基因的克隆、表达及反应原性分析

本研究克隆了羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌S2株的omp28基因并对以上不同种菌株的omp28基因序列及编码的氨基酸序列进行了比对,结果显示不同种布鲁氏菌omp28基因之间仅6个碱基不同,而且只有2个氨基酸不同,亲水性分析结果显示两处氨基酸的差异对蛋白亲水性不造成影响.将羊种布鲁氏菌16M的omp28基因亚克隆到pET32a中表达,OMP28在低温下诱导以可溶性形式高效表达.Westem-blot结果显示OMP28反应原性良好,是布鲁氏菌病诊断抗原的可能选择.     

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与GroEL基因的克隆及其原核表达

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌HtrA（High temperature requinnent A）基因、GroEL（热休克蛋白）基因设计特异性引物，从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增出HtrA、GroEL基因片段，将HtrA、GroEL基因片段纯化后分别克隆到T载体上测序，结果表明新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因片段长1542bp，编码513个氨基酸，与发表的牛种（B．abortus）、羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）的HtrA基因序列的同源性分别为99．68％、99．81％、99．55％。GroEL基因片段长1641bp，编码546个氨基酸，与B．melitensis、B．suis以及B．aborms GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％。HtrA基因和GroEL基因与发表的B．abortus、B．melitensis、B．suis的HtrA基因和GroEL基因序列的具有很高的同源性。按正确的阅读框架分别将两基因片段定向克隆到表达载体pET．28a上，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和western blot分析表明，HtrA、GroEL基因能在大肠杆菌中成功表达，表达的蛋白分子量都约为60Ku，并能和布鲁氏菌免疫兔子产生的抗体发生特异性的结合。     

布鲁氏菌内蒙古分离株omp31基因的克隆与序列分析

对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析.参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基因序列进行了比较.结果显示,三株布鲁氏菌分离株的omp31基因开放阅读框核苷酸序列同源性均为100.0%;与Brucella ceti B14/94、Brucella neotomae 5K33、Brucella suis 1330三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最高,为100.0%;与Brucella canis RM6/66、Brucella melitensis 183、Brucella melitensis 16M三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.9%;与Brucella melitensis Rev1参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.6%;与Brucella ovis ATCC 25840参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最低,为98.8%.     

AMOS PCR在布鲁氏菌种型鉴定中应用的研究

AMOSPCR是近年来在布鲁氏菌上尝试使用的一种布鲁氏菌检测方法,可作为布鲁氏菌诊断及菌种类型鉴定的PCR方法,可区分牛种布鲁氏菌1、2、4型,羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌。本试验用来自国内的疫苗S2,M5及国际上常用的布鲁氏菌疫苗S19,104M试验AMOSPCR的效果,同时对AMOSPCR扩增条带进行测序。结果表明,除国内布鲁氏菌S19检测结果与国外菌株不同外,其余的几种疫苗株都得到典型的特征性条带。同时测序结果也表明各种属条带无交叉反应,为今后国内诊断布鲁氏菌病诊断方法研究指出一个方向。     

奶牛布鲁氏菌的监测与分离鉴定

本试验采用SAT方法对乌鲁木齐地区某牛场进行了布鲁氏菌病监测,对阳性奶牛的乳汁进行细菌分离培养,用VirB8-PcR方法对分离株VirB8基因进行扩增鉴定。结果表明,2个分离株均为布鲁氏菌,布鲁氏菌分子分型PCR的鉴定结果显示该牛场感染的自然菌株为布鲁氏菌牛种（3b,5,6,9型）。     

Cloning and Sequence Analysis of Toxoplasma gondii GRA25 Gene

In this study,sequence variation of GRA25 genes among 22 Toxoplasma gondii (T.gondii) strains from different hosts and geographical locations were examined.The complete GRA25 genes from 22 T.gondii isolates were amplified,sequenced,and nucleotide variations were determined.Phylogenetic analysis among the different T.gondii isolates were conducted using maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML) methods.The biological characteristics of the protein GRA25 of the T.gondii RH strain were predicted using bioinformatics software.The sequences of all the examined T.gondii strains were 939 or 948 bp in length.Sequence comparison of all 22 GRA25 sequences identified 82 variable nucleotide positions (0 to 4.4%).The results of phylogenetic analysis showed that strains belonging to the classical typeⅠand Ⅱ could not group into their own branches based on the GRA25 sequences.Bioinformatics analysis revealed that the protein GRA25 contained 7 hydrophobicity regions,10 alpha regions,3 beta sheets,8 random coils and 8 linear B-cell epitopes.These results suggested that the GRA25 gene was not an ideal genetic marker for population genetic study of T.gondii strains,but it might represent a good vaccine candidate against toxoplasmosis.     

刚地弓形虫GRA25基因的克隆及序列分析

本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。     

Molecular Cloning,Sequence Analysis and Tissues Expression Profile of Part of Mink Toll-like Receptors (TLRs) Genes

The present study was aimed to explore the potential role of Toll-like receptors (TLRs) on the mink immunity, and accumulate alternative genetic material for the mink breeding for disease-resistant.Four pairs of primers were designed according to ferret TLR sequences in GenBank to obtain the sequences of TLR genes (TLR4, TLR6, TLR7 and TLR8) of mink and then performed bioinformatics analysis of these sequences.In addition, the expression of TLR4 and TLR7 genes in various tissues in young and adult minks were analyzed by RT-PCR. Sequence homology analysis showed that mink had higher homology with carnivora (ferrets, polar bear, panda, walrus, seals, dog, tiger and cat) which had the nearest perimeter in the phylogenetic tree.Tissue expression analysis showed that TLR4 and TLR7 were widely and differently expressed in variety tissues of mink.Interestingly, the expression of TLR4 and TLR7 in young mink were much higher than that in adult mink.