紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因cDNA的克隆、分析及烟草转化

采用RT-PCR方法,克隆得到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)GDP解离抑制蛋白基因cDNA核心区域序列,命名为MsGDI1。序列分析结果表明,该cDNA核心区域全长1575 bp,包含一个1332 bp的最大开放阅读框,编码444个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,在盐胁迫和铝胁迫条件下,MsGDI1基因的表达随着胁迫时间的增加而上升,该基因可能与紫花苜蓿抗盐耐铝机理有关。借助于新构建的该基因超表达载体,用农杆菌介导方法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。转基因烟草植株PCR检测的结果表明,MsGDI1基因已经成功插入到烟草基因组中,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

唐古特白刺蛋白激酶基因NtCIPK2超表达载体构建及紫花苜蓿转化研究

环境因素如高盐、干旱或冷冻等严重制约着豆科重要牧草紫花苜蓿的生长发育和产量。根据已发表的盐生植物唐古特白刺蛋白激酶基因NtCIPK2的序列信息(序列号KC823044),利用PCR方法扩增其编码区cDNA,连接pMD-19T simple 载体并测序,测序结果表明所克隆的DNA片段长度为1362 bp,与GenBank上公布的序列完全一致。在此基础上构建植物超表达载体pPZP221-NtCIPK2,采用CaCl₂冻融法将该表达载体转入农杆菌GV3101中,然后通过农杆菌介导的方法转化紫花苜蓿的下胚轴,形成愈伤组织后经庆大霉素筛选培养,最终获得7株抗性幼苗。对抗性幼苗进行庆大霉素基因的PCR检测,结果表明,NtCIPK2基因成功整合到紫花苜蓿基因组中,进一步对其进行外源基因的RT-PCR检测,发现只有3株幼苗中的外源基因实现了过量表达,这可能是由于基因插入位点的差异引发的基因沉默所致。本研究的开展为进一步分析转化植株在各种逆境胁迫条件的表现及其遗传稳定性,培育具有多重抗逆能力的苜蓿品种,促进苜蓿产业发展奠定基础。     

紫花苜蓿MsLEA4启动子的克隆及表达分析

为了深入研究紫花苜蓿（Medicago sativa）MsLEA4基因的功能,本试验采用染色体步移技术从紫花苜蓿基因组中扩增出MsLEA4启动子序列,构建GUS植物超表达载体,并根据序列分析结果对紫花苜蓿进行相应逆境胁迫。结果表明：紫花苜蓿MsLEA4启动子含有响应脱落酸（abscisic acid,ABA）调控的顺式作用元件ABRE,响应赤霉素（gibberellin,GA）调控的顺式作用元件P-box,参与胚乳合成的顺式作用元件GCN4和Skn-1,以及涉及光调控和光周期的顺式作用元件;外源ABA、GA、持续光照以及黑暗均能诱导MsLEA4基因的表达;GUS基因只在拟南芥花和荚果中表达。因此,MsLEA4基因能参与紫花苜蓿的逆境调控,与该基因启动子序列中所含的一系列顺式作用元件相关。本研究为进一步探索MsLEA4基因在紫花苜蓿逆境胁迫、光调控以及组织特异性表达中的作用奠定了基础。     

银黑狐MC1R基因核心启动子区的鉴定

【目的】确定银黑狐黑素皮质激素受体1（melanocortin 1 receptor，MC1R）基因的核心启动子区，为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。【方法】以银黑狐基因组DNA为模板，PCR扩增获得MC1R基因5'-UTR区序列，利用3个在线生物学软件综合预测MC1R基因启动子活性区；PCR扩增获得该基因5'-UTR区不同长度的缺失片段，并克隆至pMD19-T载体，将重组质粒转染至黑色素B16细胞中，利用双荧光素酶检测技术对10个缺失片段进行荧光素酶活性检测。【结果】成功获得银黑狐MC1R基因5'-UTR区序列，软件预测显示－596/＋73 bp可能为启动子活性区。双荧光素酶活性检测发现，构建的10个缺失片段的荧光素酶表达载体均具有启动子活性，其中pGL3-MC1RP8（－520/＋73 bp）有较强的活性，提示其为核心启动子区，与软件预测结果基本一致。【结论】试验确定了银黑狐MC1R基因的核心启动子区为―520/＋73 bp，为深入研究该基因的毛色调控机制奠定了理论基础。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。     

冷诱导转录因子AtCBF1转化紫花苜蓿的研究

为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草紫花苜蓿的抗寒性改良作用,本实验以拟南芥基因组DNA为模板,利用PCR方法克隆得到了冷诱导转录因子AtCBF1基因,测序结果表明所克隆的DNA片段长度为642 bp, 将该序列与GenBank上的CBF1基因序列进行DANMAN序列比较分析,同源性可达99.84%。在此基础上成功构建了含有AtCBF1基因的植物表达载体pBI121-CBF1,并采用根癌农杆菌介导法对紫花苜蓿进行了遗传转化,获得了经卡那霉素筛选的抗性转化植株,进一步经PCR和RT-PCR检测,得到了650 bp左右的电泳条带,表明AtCBF1基因已在紫花苜蓿中得到表达。这为选育紫花苜蓿抗寒新品种奠定了良好的基础。     

东方山羊豆GoMIPS双元表达载体的构建及鉴定

 从东方山羊豆（Galega.orientalisL.）中克隆出的GoMIPS（肌醇-1-磷酸合成酶）基因序列设计合成1对带有NcoI和SpeI酶切位点的引物,用RT-PCR方法从东方山羊豆幼嫩叶片总RNA中扩增出GoMIPS基因的cDNA序列,经纯化后,克隆至pMD19-T载体上,构建pMD-MIPS的中间载体,测序鉴定。然后用NcoI和SpeI限制性酶对含有目的基因的pMD-MIPS和pCAMBIA1302空载体进行双酶切,通过酶切鉴定和测序分析表明,已成功构建了CaMV35S启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302-MIPS。     

紫花苜蓿bZIP转录因子MsbZIP1的克隆、表达特性和遗传转化分析

bZIP（Basic leucine zipper）是植物中一类非常重要的转录因子,参与植物从生长发育到抗性调控的多个生物学过程。为了了解紫花苜蓿（Medicago sativa）中bZIP转录因子的特性,解析紫花苜蓿MsbZIP1基因的生物学功能,从而阐述MsbZIP1基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制,本研究利用RACE技术从紫花苜蓿中获得1个MsbZIP1基因的全长cDNA,该序列全长1 176 bp,编码361个氨基酸,预测分子量为42.3 kD,等电点为6.5。分析发现,该蛋白含有bZIP家族典型的BRLZ碱性结构域和亮氨酸拉链,属于bZIP家族蛋白。进化树分析表明,该蛋白属于bZIP转录因子C亚族,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtbZIP63具有很高的同源性,推测可能具有与该类蛋白相似的功能。qRT-PCR分析表明,MsbZIP1基因对干旱、高盐、高温、低温,以及脱落酸（Abscisic acid,ABA）和生长素（Auxin,IAA）处理都有不同程度的响应,推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1,以农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,经后代筛选、扩繁和分子检测,得到7株超表达的转基因拟南芥。本研究第一次分离了紫花苜蓿C亚族bZIP转录因子,初步确定紫花苜蓿MsbZIP1基因响应多种逆境胁迫的反应,并获得了阳性转基因材料,并为进一步探索该类转录因子在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

无芒隐子草SAMS1基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

以无芒隐子草干旱诱导的cDNA文库中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性较高的EST序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因全长序列(命名为CsSAMS1),该序列全长1 399 bp,编码397个氨基酸,具有SAMS基因的典型结构特征。无芒隐子草SAMS1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,其空间结构主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成。与近缘植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高(92%~100%), 其中无芒隐子草与水稻的相似性最高(99%), 说明SAMS基因在植物进化中非常保守。CsSAMS1基因在无芒隐子草幼苗干旱过程中的半定量和实时定量RT-PCR表达模式分析均表明,干旱胁迫诱导该基因在根中大量表达, 叶中表达量变化不明显。CsSAMS1基因受干旱胁迫的诱导表达,为进一步探讨其应用于草类作物抗旱性的遗传改良奠定了基础。     

紫花苜蓿MsFPS基因超表达载体的构建及烟草转化

采用RT-PCR技术获得紫花苜蓿的法呢基焦磷酸合成酶基因,并连接到含有35S启动子和GUS基因的载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-FPS.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得7株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中.进一步对这4株进行RT- PCR和组织化学染色法检测,初步证实目的基因在烟草中可以表达,说明已成功获得能够表达MsFPS基因的转基因烟草.     

箭筈豌豆炭疽病病原菌分离鉴定

箭筈豌豆炭疽病是一类重要的真菌性病害。采用形态学特征观察结合基于内转录间隔区(ITS)、肌动蛋白(ACT)、几丁质酶(CHS1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH) 4个基因序列的多基因系统发育分析方法来鉴定甘肃夏河箭筈豌豆炭疽病的病原菌。结果表明,菌株WQ在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上的菌落平坦,正面为深灰色-橄榄色至橄榄色-黑色,边缘菌丝白色,背面灰色-橄榄色至铁灰色。分生孢子单胞透明,大小为(17.5~25.0) μm×(3.75~5.00) μm,略呈镰刀形。菌株WQ与编号为CBS 128.57的菌株同源性最高,在70%水平上聚为一支。病原菌可以通过伤口侵染箭筈豌豆叶片。确定箭筈豌豆炭疽病病原菌为菠菜炭疽菌,这是箭筈豌豆菠菜炭疽菌在中国的首次报道。寄主范围测定结果表明,病原菌对红豆草和燕麦均具有强致病性,对4个品种的箭筈豌豆具有中等致病性,对苜蓿和三叶草的致病性最低,而对黑麦草无致病性。     

紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因的表达及抗逆性分析

根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(MET1, 登录号:AF189766.1)cDNA序列设计一对特异性引物,以紫花苜蓿品种“农菁1号”的cDNA为模板,利用PCR技术克隆出的一个基因,命名为MsMT1,测序发现该基因全长228 bp,编码75个氨基酸。通过碱基序列比对发现MsMT1与MET1的相似度为99%。通过氨基酸序列分析和进化树分析,发现与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性。利用qRT-PCR对MsMT1在苜蓿不同器官中的表达进行分析,发现该基因在根和子叶中表达量较高。将苜蓿幼苗进行不同浓度NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃及不同pH值胁迫处理后, 观察MsMT1基因的表达,发现MsMT1的表达量随盐碱处理液浓度和pH值变化发生改变,说明MsMT1与植物的抗逆性相关。采用农杆菌介导法将MsMT1导入苜蓿植株体内,卡那抗性的筛选和Northern blot结果显示MsMT1基因能够在转基因苜蓿中高效表达。用不同浓度NaCl、NaHCO₃处理野生型和转化MsMT1基因的苜蓿幼苗,观察幼苗受胁迫后的表型,发现转基因的苜蓿幼苗比未转基因的苜蓿幼苗抵抗力高。本研究表明MsMT1基因能够增加苜蓿对胁迫的抗性。     

刈割对五节芒化感作用及次生代谢物质的影响

本文研究了刈割后五节芒(Miscanthus floridulus)叶、茎、根和根际土浸提液对生菜(Lactuca sativa)化感作用的影响,并运用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术鉴定刈割与未刈割之间五节芒叶片中次生代谢物质的差异。结果表明,不同浓度浸提液对生菜种子萌发、胚根长、子叶长、子叶宽、鲜重影响差异较大,其中五节芒叶片浸提液显著抑制生菜胚根的生长,刈割后五节芒化感效应指数比未刈割增加2~8倍;次生代谢物质组分分离后,发现抑制生菜生长的次生代谢物质主要是有机酸类物质;GC-MS总离子流图显示刈割组波峰数量明显增多,并且各峰峰度最大值高于对照1.35~5.15倍,说明刈割后五节芒叶片中次生代谢物质种类及其含量明显增加。刈割后五节芒叶片新出现3种次生代谢物质,多种次生代谢物质的相对含量明显增加,其中植物竞争类次生代谢物质(棕榈酸、亚油酸、豆甾醇)和抑制天敌次生代谢物质(反-乌头酸)相对含量增幅较大,这些次生代谢物质可能是五节芒应对刈割胁迫的化学防御物质。     

紫花苜蓿BAN基因的克隆及其生物信息学分析

BANYULS(BAN)基因编码的花青素还原酶是缩合单宁合成有关的一个关键酶.利用同源克隆的原理,采用RACE的方法,从紫花苜蓿中克隆得到了BAN基因(MsBAN),并对其进行了初步的分析.该基因cDNA全长1313bp,包括开放阅读框1017bp,编码339个氨基酸,在N端存在一个NADP结合位点“VIGGTGFVASLLIKQLLEKGY”.实时荧光定量PCR结果表明,该基因在紫花苜蓿荚果中表达量最高,花中最弱.在NaCl和PEG诱导下,MsBAN基因表达量明显高于对照.在外源激素ABA和GA3处理下,该基因被诱导表达.表明单宁可能在紫花苜蓿的抗逆性调控中也起到一定的作用.     

单宁酸溶液对低温胁迫下紫花苜蓿膜透性的影响

应用植物叶片膜透性的测定方法研究了外施单宁酸溶液,对紫花苜蓿幼苗膜透性的影响,结果表明:随着低温处理时间的延长,不同浓度的单宁酸处理的苜蓿叶片膜透性都有所增加,但增加速率不同,为:V0>V0.25>V0.5>V1;经浓度为0.5%,1%的单宁酸溶液处理过的苜蓿幼苗,其膜透性均明显高于未经单宁酸溶液处理的苜蓿幼苗(P<0.01);经浓度为0.25%的单宁酸处理过的苜蓿幼苗,其膜透性变化在低温处理时间为0 h,2 h和4 h差异不显著,但在处理6 h的时候差异性显著(P<0.05);随着单宁酸溶液浓度的增加,每个处理时间上苜蓿幼苗的膜透性逐渐减小,保护性作用逐渐加强。此研究结果为单宁酸溶液能提高苜蓿抗寒性,减轻低温伤害提供有效的理论依据。     

溶磷菌分泌有机酸与溶磷能力相关性研究

为了研究溶磷菌的溶磷机理,探究溶磷菌分泌有机酸的种类和数量与溶磷能力的相关性。利用PKO无机磷液体培养基对筛选自兰州周边的苜蓿(Medicago sativa)、白三叶(Trifolium repens)和红三叶(Trifolium pratense)根际的6株溶磷菌进行液体培养,采用钼蓝比色法和高效液相色谱法测定溶磷量及分泌有机酸的种类和数量。结果表明,各菌株溶磷量差异显著(P<0.01),有效磷增量在106.53~373.44 mg·L^-1之间。供试菌株分泌有机酸的种类主要有草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和丁二酸等,但分泌有机酸的种类和数量差异较大。溶磷菌的溶磷量与总有机酸量间存在一定相关性,但有效磷增量并不完全由总有机酸量来决定,有机酸的种类和数量对溶磷量也有一定的影响,各种有机酸对溶磷量的影响程度和作用机理有待进一步研究。     

红豆草与紫花苜蓿的培肥效果研究

通过田间小区试验,对比研究了种植豆科牧草红豆草Onobrychis viciaefolia和紫花苜蓿Medicagosativa的产草量和对土壤肥力影响的差异,结果表明:种植当年红豆草产草量大于紫花苜蓿,分别为3 273.0和860.5 kg/hm2,种植次年产草量均有增加,但紫花苜蓿增加明显,分别为3 548.0和1 454.5 kg/hm2,种植第3年红豆草的产草量开始减少,为2 908.0 kg/hm2,紫花苜蓿继续增加至3 535.0 kg/hm2.种植2种豆科牧草均有培肥地力的作用,种植年限越长,有机质和氮素的积累越多,且红豆草培肥作用强于紫花苜蓿.种植2年后.红豆草和紫花苜蓿的耕层有机质含量分别比试验初增加0.74和0.54 g/kg.全氮增加0.466和0.317g/kg,水解氮增加7.9和5.6 mg/kg.2种豆科牧草种植年限越长,土壤中的磷素越低,种植2年后,红豆草和紫花苜蓿的耕层速效磷分别减小4.1和4.6 mg/kg,因此建议每次刈割后结合中耕适当增施磷肥.