Agouti基因及其与动物毛色关系的研究进展

动物特别是毛皮动物,毛纤维颜色丰富多彩,其主要由遗传基因调控,在众多的调控基因中,Agouti基因是一个重要的功能基因。论文重点综述了Agouti基因结构及其在人、小鼠、家养普通动物和毛皮动物毛色方面的研究现状,旨在为动物毛色选育提供参考依据。     

靶向食蟹猴NTCP基因的CRISPR/Cas9系统gRNA筛选

本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列,选择差异位点,即第84-87位和第157-165位氨基酸作为基因靶点序列区;利用gRNA软件设计针对上述基因靶点序列的gRNA,每个靶点设计3~4条候选gRNA序列;然后利用gRNA体外检测试剂盒,筛选出靶向NTCP基因的体外敲除活性较高的两条gRNA序列：gRNA1.2和gRNA2.1。将gRNA1.2和gRNA2.1分别插入pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP载体中,转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组DNA,通过PCR扩增NTCP基因并将其克隆到T载体中进行测序分析。结果表明,gRNA1.2和gRNA2.1均可使NTCP基因产生移码突变,但gRNA2.1比gRNA1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴NTCP基因及研究其在乙型肝炎病毒（HBV）感染中的功能奠定了基础。     

银黑狐TYRP1基因CDS区鉴定及生物信息学分析

为了探明酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)基因对狐狸毛色的调控机制,本研究利用RT-PCR、染色体步移和核酸测序等技术,获得了银黑狐TYRP1基因完整编码区(coding DNA sequence,CDS),利用ProtParam和PredictProtein等在线软件对该基因进行了生物信息学分析,并利用Lasergene7.1软件包进行银黑狐与其他物种间的同源性分析及系统进化树的构建。结果表明,银黑狐TYRP1基因CDS区共计1 614bp,编码537个氨基酸残基,属于不稳定可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位主要在内质网和高尔基体中,属于分泌蛋白。在第24和25个氨基酸之间存在1个裂解位点,存在信号肽。其属跨膜蛋白,包括跨膜域、胞外域和胞内域3个部分。二级结构以无规则卷曲为主(59.03%),α-螺旋占22.91%,属卷曲蛋白质。三级结构与二级结构预测结果基本一致,主要是由无规则卷曲和α-螺旋构成。银黑狐与其他10个物种间的相似度为88.6%~99.6%,说明物种之间同源性较高,TYRP1基因编码区在进化过程中保守性较强。系统进化分析提示,银黑狐与赤狐和家犬的遗传亲缘关系最近。银黑狐TYRP1基因编码区的成功获取及分析为进一步探讨其在毛色形成过程中的功能研究提供了较好的理论依据。     

银黑狐MC1R基因核心启动子区的鉴定

【目的】确定银黑狐黑素皮质激素受体1（melanocortin 1 receptor，MC1R）基因的核心启动子区，为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。【方法】以银黑狐基因组DNA为模板，PCR扩增获得MC1R基因5'-UTR区序列，利用3个在线生物学软件综合预测MC1R基因启动子活性区；PCR扩增获得该基因5'-UTR区不同长度的缺失片段，并克隆至pMD19-T载体，将重组质粒转染至黑色素B16细胞中，利用双荧光素酶检测技术对10个缺失片段进行荧光素酶活性检测。【结果】成功获得银黑狐MC1R基因5'-UTR区序列，软件预测显示－596/＋73 bp可能为启动子活性区。双荧光素酶活性检测发现，构建的10个缺失片段的荧光素酶表达载体均具有启动子活性，其中pGL3-MC1RP8（－520/＋73 bp）有较强的活性，提示其为核心启动子区，与软件预测结果基本一致。【结论】试验确定了银黑狐MC1R基因的核心启动子区为―520/＋73 bp，为深入研究该基因的毛色调控机制奠定了理论基础。