犬瘟热重组N蛋白抗原间接ELISA方法的建立及应用

本研究以纯化的犬瘟热病毒（CDV）重组N蛋白为诊断抗原,建立了犬瘟热病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法,将其命名为rN-CDVELISA。确定最佳抗原包被量为0．167μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1：100,其作用时间为45min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1：2000,作用时间为60min,S／P值≥0．208者判为阳性,S／P值≤0．16者判为阴性,介于两者之间者判为可疑。该抗原不与犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副粘病毒、犬波特氏杆菌等4种疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数均小于15％,具有良好的重复性;检测血清样品96份,与进口诊断试剂盒的符合率为97．1％。本研究为现地免疫犬群抗体检测和进行CDV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。     

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究以纯化的犬细小病毒（CPV）重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA方法,其抗原包被浓度为0．158微克／毫升;待检血清稀释倍数为1：100,作用时间为60分钟：羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1：2000,作用时间为60分钟;底物作用时间为10分钟;判定标准为S／P≥0．282时为阳性．S／P≤0．226时为阴性。该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆菌病等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15％．显示该方法具有良好的重复性;     

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究以纯化的犬细小病毒(CPV)重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA 方法,其抗原包被浓度为0.158μg/mL;待检血清稀释倍数为1:100,作用时间为60 min;羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2 000,作用时间为60 min;底物作用时间为10 min;判定标准为S/P≥O.282时为阳性,S/P≤0.226时为阴性.该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆茵痛等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15%,显示该方法具有良好的重复性;与商品化CPV ELISA试剂盒进行比较,符合率为96.5%.本研究为现地免疫犬群抗体监测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

试验以利用重组弓形虫SAG1基因转染蜥蜴利什曼原虫所表达获得的目的蛋白作为包被抗原,建立了一种快速、特异、可检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为6.75 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,对已知阳性血清检测的下限可达1∶6400,批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,包被抗原的酶标板在4、-20 ℃环境中可保存8个月以上。建立的间接ELISA方法应用于犬弓形虫抗体的检测具有较好的敏感性及特异性。     

猪细小病毒病血清抗体VP2-ELISA检测方法的建立

利用纯化的猪细小病毒VP2蛋白为抗原,建立检测猪细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA。最佳反应条件为:抗原包被浓度300 ng/孔,4℃过夜,待检测血清1:50稀释。与猪细小病毒病阳性血清呈阳性反应,与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪日本脑炎和猪圆环病毒病等5种疾病的阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数均小于10%。用该方法与Ceditest PPV猪细小病毒抗体检测试剂盒对102份血清进行平行检测和比较,间接VP2-ELISA的敏感性为93.8%,特异性为81.1%,符合率为89.2%。结果表明,猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪细小病毒感染的血清抗体检测。     

鸡传染性贫血重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测鸡传染性贫血病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法.确定了抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清最适稀释度为1:100,其作用时间为60min,酶标抗体最适作用时间为60min,S/P≥0.24为阳性,≤0.19为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准.该抗原不与鸡其他疾病的10种阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%,批间重复试验,变异系数小于15%,具有良很好的重复性;该方法可检出人工接毒后20d的血清抗体,直到试验结束110 d时,仍能检出鸡血清阳性率为81%与全病毒包被抗原ELISA方法的检测结果符合率达92%以上,与进口诊断试剂盒的符合率为97%.本研究为现地免疫鸡群抗体检测和进行CIA流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立

将狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G蛋白)中和抗原表位串联表达的重组蛋白作为抗原,建立了检测RV中和抗体的间接ELISA技术。结果表明,最佳抗原包被量为2μg/孔,被检血清最佳稀释倍数为1:200。该方法与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的阳性符合率为88%,阴性符合率为96%。特异性试验表明,该抗原不与犬腺病毒I型、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒阳性血清发生交叉反应,具有良好的特异性。板内和板间重复性试验的平均变异系数分别为2.7%和4.2%,具有良好的重复性,为动物RV中和抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

山羊痘病毒G9蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

山羊痘病毒(GTPV)G9是一种膜蛋白,是潜在的优势抗原,为建立检测山羊痘的间接ELISA方法,本研究克隆GTPV G9基因并原核表达了重组G9蛋白,利用该蛋白作为包被抗原,经各反应条件优化建立了检测GTPV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示,原核表达的重组G9蛋白约为39 ku,且可以与GTPV阳性山羊血清发生特异性反应。间接ELISA方法经优化后的最佳条件为:重组G9蛋白的最佳包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释度为1.80,鼠抗羊HRP-IgG的最佳稀释度为1.10 000。特异性结果显示,除GTPV阳性山羊血清检测结果为阳性外,副结核分支杆菌、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、布鲁氏菌的阳性山羊血清的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,GTPV阳性山羊血清1.320稀释后检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内、批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。利用本实验建立的间接ELISA方法检测45份临床山羊血清样品的结果显示,阳性血清8份,阴性血清37份,阳性率为17.8%;商品化ELISA试剂盒的检测结果显示,阳性血清9份,阴性血清36份,阳性率为20%。二者的符合率为97.8%。本研究为GTPV抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。