内蒙古绒山羊角蛋白5基因启动子克隆及序列分析

试验旨在了解角蛋白5(keratin 5, K5)可能的调控序列。本研究根据UCSC公布的牛K5基因5'侧翼区设计PCR引物,扩增了内蒙古绒山羊K5基因部分启动子序列。通过产物纯化、连接、转化,并对测序结果进行了生物信息学分析。结果扩增得到内蒙古绒山羊K5基因启动子序列长度为1452 bp(GenBank登录号为:JQ277735),与牛和人相应序列的相似性分别为91.5%和74%。转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游－101 bp位置;含有两个TATA 盒,分别位于翻译起始位点上游－129—－124 bp(ATAAAA)和－178—－174 bp(TTAAT)位置;通过在线分析软件预测发现(按5'→3')SRY,MZF1,v-Myb,SRY,AP-1,CDP CR,HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,AP2,Sp1,Nkx-2,Sp1和GATA-1转录因子结合位点。其中,转录因子SRY(TGTGTTT),和CDP CR(GATTGATGGC)是绒山羊特有的;转录因子HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,Sp1,Nkx-2和GATA-1(AGCCATCATG)在绒山羊、牛和人K5启动子上的结合位点高度保守。两个最小增强子分别位于翻译起始位点ATG上游－140—－91 bp和－114—－67 bp位置,含有24 bp(GCGGCTCCCAGGTAACAGAGCCGC)重叠区,预测其与绒山羊K5基因的转录调控有关。试验确定了内蒙古绒山羊K5基因启动子的转录起始位置、转录因子结合位点及最小增强子序列,为进一步研究绒山羊K5基因的表达调控机制奠定了理论基础。     

山羊角蛋白14基因启动子分析及其多态性研究

以内蒙古白绒山羊DNA为模板,参照牛的角蛋白14(keratin 14,K14)基因序列设计引物,PCR扩增获得长度为2834 bp(GenBank登录号:JQ063036)的片段,包括山羊K14基因启动子区2631 bp和结构基因第1外显子区203 bp。序列比对山羊K14基因启动子序列及其多态性分析结果发现,山羊K14基因启动子结构与人K14基因启动子不同,只含有Sox-5、GATA-1、GATA-1/2结合位点等3个共同的转录因子结合位点。但与牛K14基因启动子有较高的相似性,含有Sox-5、SRY、CdxA、MyoD、MZF1、GATA-1/3、Nkx-2结合位点等7个共同的转录因子结合位点;并发现山羊K14基因启动子区存在deltaE、GATA-2、GATA-1、Sp-1、AML-1a等5处独有的转录因子结合位点。此外,对山羊K14基因启动子进行多态性分析,发现4处单核苷酸多态位点,其中2处SNPs位于Nkx-2(-2004--1996 bp)转录因子结合位点或Nkx-2(-1590--1583 bp)临近几个碱基内。     

牛GDF9基因5′侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用。本研究克隆了牛GDF9基因5′侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5′侧翼区没有CpG岛;利用Promoter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件,如1个TATA-box、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域。     

关岭牛肌球蛋白重链1基因5′侧翼启动子的克隆和生物信息学分析

本试验旨在进行关岭牛肌球蛋白重链1(myosin heavy chain 1,MYH1)5′侧翼启动子的克隆和生物信息学分析。采集关岭牛血液及组织样品(背最长肌、后腿肌、心脏、肝脏、小肠、脂肪组织),利用PCR方法扩增关岭牛MYH1基因5′侧翼区,构建关岭牛pUCm-T-MYH1克隆载体,并对MYH1基因5′侧翼区进行生物信息学分析,最后利用实时荧光定量PCR法测定了MYH1基因在关岭牛不同组织中的表达。结果显示,本试验成功获得1 373bp(-1 360~+12bp)的MYH1基因5′侧翼启动子序列;利用生物信息软件对获得的克隆序列进行分析发现,MYH1基因5′侧翼启动子序列存在5处可能的转录起始点和多个潜在转录因子结合位点;关岭牛与金丝猴、野猪、家鼠、藏羚羊、野驴的MYH1基因5′侧翼区保守性较强的区域为转录起始点上游-400~+100bp,推测转录起始点上游-400~+75bp可能是其核心启动子区域。实时荧光定量PCR分析发现,MYH1基因在关岭牛背最长肌和后腿肌中高表达,在心脏、肝脏、小肠、脂肪组织中表达量很低,说明MYH1基因表达具有组织特异性。     

牛GDF9基因5'侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子B(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用.本研究克隆了牛GDF9基因5,侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5'侧翼区没有CpG岛;利用Promter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件.如1个TATA-bo、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域.     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

关岭牛肌球蛋白重链1基因5'侧翼启动子的克隆和生物信息学分析

本试验旨在进行关岭牛肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1,MYH1）5'侧翼启动子的克隆和生物信息学分析。采集关岭牛血液及组织样品（背最长肌、后腿肌、心脏、肝脏、小肠、脂肪组织）,利用PCR方法扩增关岭牛MYH1基因5'侧翼区,构建关岭牛pUCm-T-MYH1克隆载体,并对MYH1基因5'侧翼区进行生物信息学分析,最后利用实时荧光定量PCR法测定了MYH1基因在关岭牛不同组织中的表达。结果显示,本试验成功获得1 373 bp（-1 360~+12 bp）的MYH1基因5'侧翼启动子序列;利用生物信息软件对获得的克隆序列进行分析发现,MYH1基因5'侧翼启动子序列存在5处可能的转录起始点和多个潜在转录因子结合位点;关岭牛与金丝猴、野猪、家鼠、藏羚羊、野驴的MYH1基因5'侧翼区保守性较强的区域为转录起始点上游-400~+100 bp,推测转录起始点上游-400~+75 bp可能是其核心启动子区域。实时荧光定量PCR分析发现,MYH1基因在关岭牛背最长肌和后腿肌中高表达,在心脏、肝脏、小肠、脂肪组织中表达量很低,说明MYH1基因表达具有组织特异性。     

贵州白山羊MyoG基因启动子区序列克隆及生物信息学分析

【目的】本研究旨在解析肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列的结构特性及其转录调控机制。【方法】以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,设计2对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术获得MyoG基因启动子区序列,通过DNAStar和Mega 5.0软件分别进行不同物种MyoG基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学软件预测分析该序列核心启动子区、转录因子结合位点、顺式作用元件、CpG岛等结构特征。【结果】贵州白山羊MyoG基因启动子区序列长2 334 bp,包括2 092 bp的5′-侧翼序列和242 bp的外显子1,GC含量略低于AT含量。通过不同物种比对分析,贵州白山羊MyoG基因启动子区序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和鸡同源序列相似性分别为98.34%、96.15%、77.76%、74.15%、57.63%和43.04%。系统进化树结果表明,贵州白山羊与绵羊和牛的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学结构预测发现,贵州白山羊MyoG基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游50 bp, 5′-侧翼区存在1个潜在的启动子区域和1个CpG岛,含有1个TATA...     

蒙古羊GDF11基因启动子区克隆及序列分析

为了研究生长分化因子11(growth differentiation factor,GDF11)基因与蒙古羊多脊椎性状间的关系,本研究首先克隆了该基因启动子区序列,并采用相关生物信息学软件对该序列进行了分析。结果得到512 bp的蒙古羊GDF11基因启动子区序列,整个序列碱基构成为A占10.55%,G占16.80%,T占31.84%,C占40.82%,整个序列G+C含量百分比为57.62%。通过在线软件对蒙古羊GDF11基因启动子区生物信息学分析结果表明,该区域未找到符合条件的CpG岛,也未发现TATA box或CAAT box结构,但存在一处潜在的转录起始位点和HSF2、HSF2、GATA-1、AML-1a和MZF1 5个潜在转录因子,并且具有5种基序结构:EGF_1、CTCK_1、ANAPHYLATOXIN_1、VWFC_1和DEFENSIN。本研究结果为进一步揭示该基因对蒙古羊脊椎数的调控机理提供了重要的理论依据。     

贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著（P〉0.05）,表明GDF9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。     

贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF 9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF 9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF 9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著（P＞0.05）,表明GDF 9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。     

山羊卵巢褪黑素信号特异性载体pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT与pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A/B的构建

本研究旨在构建褪黑素（melatonin，MLT）合成酶乙酰血清素甲基转移酶（acetylserotonin methytransferase，ASMT）的卵母细胞特异表达载体GDF9-ASMT和MLT受体（MTNR1A与MTNR1B）的颗粒（黄体）细胞特异表达载体Cyp17-MTNR1A、MTNR1B，以期为进一步生产高繁殖力转基因山羊提供载体材料。首先，分别扩增出山羊生长分化因子9（GDF9）与细胞色素P450家族17亚家族A成员1（Cyp17a1）启动子序列备用；然后，扩增ASMT、MTNR1A及MTNR1B基因CDS全长序列，并通过酶切将ASMT连接至GDF9启动子下游，将MTNR1A和MTNR1B连接至Cyp17a1启动子下游，制备出Pro/GDF9-ASMT、Pro/Cyp17-MTNR1A与Pro/Cyp17-MTNR1B表达元件；最后通过酶切连接将上述表达元件整合至pcDNA3.1（+）载体中，从而构建出pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT、pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A和pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B真核表达载体。经测序验证，本研究扩增出的GDF9和Cyp17a1启动子长度分别为2 496和2 497 bp，与GenBank数据库中山羊GDF9和Cyp17a1基因起始密码子上游2 500 bp区域的同源性均为98%；扩增出的ASMT、MTNR1A与MTNR1B的CDS序列长度分别为1 037、1 100和1 130 bp，与GenBank所递交的标准序列同源性分别为98%、98%和99%，氨基酸序列同源性分别为97%、98%和99%。上述载体的成功构建可为进一步生产褪黑素高繁殖力转基因山羊提供参考。     

猪PLEl基因启动子克隆及序列分析

通过巢式PCR方法获得猪PI。E1基因5’端上游启动子序列，通过T／A克隆法对PI。E1基因的启动子进行克隆，并对PCR鉴定为阳性的克隆子进行测序，参考人、啮齿类的羧酸酯酶家族的启动子结构，并利用启动子在线分析软件对其进行生物信息学分析。结果成功克隆得到PI。E1基因5’端上游1153bp的调控片段，分析表明该调控区没有CpG岛，也不存在典型的TATA盒结构；有2个转录起始位点分别位于翻译起始密码子ATG上游-39bp和-37bp处，潜在的转录因子结合位点有C／EBP、Spl、USF、CdxA、GATA-X、GATA-1、GATA-2、GATA-3、MZFl、AML-la、SRY、Nkx-2、LyLl、deltaE等。另外还发现了7种基序分别为EGF-1、INTEGRINBETA、CTCKl、ANA—PHYIJATOXIN-1、THIOLASE-3、TUBUI，IN、VWFC-1。研究结果可为进-步揭示PLEl基因转录调控机制提供理论参考。     

The Construction of the Goat Ovary Melatonin Signal Specific Vectors pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT and pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A and MTNR1B

This study intended to construct an oocyte-specific expression vector (GDF9-ASMT) for melatonin (MLT) synthetase acetylserotonin methytransferase (ASMT),and granule (luteal) cell-specific expression vector (Cyp17-MTNR1A,MTNR1B) for MLT receptors MTNR1A and MTNR1B,the construction of the above vectors provided carrier materials for further production of transgenic sheep with high fertility.First,the goat GDF9 and Cyp17a1 promoter sequences were amplified separately.Then,the full-length CDS sequences of ASMT,MTNR1A and MTNR1B genes were amplified,and ASMT gene was connected to the downstream of GDF9 promoter by enzyme-cutting,with MTNR1A and MTNR1B respectively connected to the downstream of Cyp17a1 promoter to prepare Pro/GDF9-ASMT,Pro/Cyp17-MTNR1A and Pro/Cyp17-MTNR1B expression elements.Finally,the above-mentioned expression elements were integrated into the pcDNA3.1(+) vector by enzyme digestion,thereby constructing pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT,pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A and pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B eukaryotic expression vectors.After sequencing verification,the GDF9 and Cyp17a1 promoters amplified in this study were 2 496 and 2 497 bp in length respectively,and they were 98% homologous to the 2 500 bp region upstream of the start codons of the goat GDF9 and Cyp17a1 genes in GenBank database.The amplified ASMT,MTNR1A and MTNR1B CDS sequence lengths were 1 037,1 100 and 1 130 bp,and the homology with the standard sequences submitted by GenBank were 98%,98% and 99%.The amino acid sequence homologies was 97%,98%,99% respectively.The construction of the above vectors provided references for further production of melatonin transgenic sheep with high fertility.     

奶牛性别鉴定的研究与应用

 以控制部分绵、山羊品种高繁殖力的BMPR IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR RFLP方法分析闽东山羊BMPR IB,BMP15 和GDF9 基因多态性与繁殖性状的关系。研究发现：多胎品种闽东山羊及南江黄羊在BMPR IB 基因的相应位置上并未发生与Booroola Merino 羊相同的突变,同时也未检测到BMP15 的FecXI, FecXH , FecXB基因及GDF9的FecGH 基因,因此排除了这5个突变位点影响闽东山羊高繁殖力性状的可能性。然而,由于闽东山羊的BMPR IB、BMP15、GDF9 的全基因序列信息的缺乏,尚不能完全断定3个基因对闽东山羊高繁殖力性状没有影响。     

BMPR-IB、BMP15、GDF9基因作为闽东山羊多胎性能候选基因的研究

以控制部分绵、山羊品种高繁殖力的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法分析闽东山羊BMPR-IB,BMP15和GDF9基因多态性与繁殖性状的关系。研究发现：多胎品种闽东山羊及南江黄羊在BMPR-IB基因的相应位置上并未发生与Booroola Merino羊相同的突变,同时也未检测到BMP15的FecXI,FecXH,FecXB基因及GDF9的FecGH基因,因此排除了这5个突变位点影响闽东山羊高繁殖力性状的可能性。然而,由于闽东山羊的BMPR-IB、BMP15、GDF9的全基因序列信息的缺乏,尚不能完全断定3个基因对闽东山羊高繁殖力性状没有影响。