3种转染试剂对牛原代骨骼肌卫星细胞转染条件的优化

为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及Hoechst 33342染色评价转染效率。结果表明,对于同一时期、同一转染试剂,pcDNA3.1-EGFP转染效果优于pEGFP-C1;不同转染试剂之间,Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染效果优于FuGENE HD。Lipofectamine 3000转染后分化72h肌管最明显,FuGENE HD次之,X-tremeGENE HP转染后细胞死亡较多。采用1.0μL Lipofectamine 3000、1.5μL Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染细胞后EGFP表达量极显著高于FuGENE HD (P<0.01),但这三者之间差异不显著(P>0.05)。细胞转染效率与EGFP定量结果基本一致,1.0、1.5μL Lipofectamine 3000转染效率较高,分别达26.07%和24.77%,极显著高于FuGENE HD(5.59%)和X-tremeGENE HP(10.87%)的转染效率(P<0.01),但二者之间无显著差异(P>0.05);X-tremeGENE HP的转染效率极显著高于FuGENE HD (P<0.01)。综合考虑转染试剂的用量、细胞毒性及经济效益,本试验初步认为牛原代骨骼肌卫星细胞转染宜采用Lipofectamine 3000,其与质粒DNA的比例为1∶1时转染效率最高。本试验结果可为原代细胞的转染提供重要的参考价值。     

不同转染试剂对大鼠原代间质细胞转染效率的比较分析

目的:为了比较不同转染试剂的转染效率,本实验以大白鼠原代细胞为模型比较了两种不同转染试剂的效果。方法:以p EGFP为报告基因,用两种转染试剂转染大鼠睾丸间质细胞,用荧光显微镜观察,分析两种转染试剂的转染效率。结果:在质粒为0.75μg和lipofectamine3000为0.75μl情况下,lipofectamine 3000转染效率最高(P0.05),lipofectamine 3000转染效率高于lipofectamine LTX。结论:与lipofectamine LTX相比,lipofectamine3000具有转染效率高、剂量低和操作方便的优点。     

鸡巨噬细胞HD11不同转染方法的比较分析

以鸡巨噬细胞HD11作为研究对象,分别采用5种不同的脂质体试剂转染和电转方法将含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒转入HD11细胞中,然后通过比较并筛选出适合鸡巨噬细胞HD11的最佳转染方法。结果显示:Lipofectamine 2000 Reagent、Attractene Transfection Reagent和Trans IT-2020 Transfection Reagent几种常见的脂质体转染试剂并不适用于HD11细胞转染。而Coming Transfection Reagent、Lip2000 Transfection Reagent脂质体转染试剂和电转可用于HD11细胞转染;其中,Lip2000 Transfection Reagent转染试剂效果最好。在此基础上,通过进一步优化得出:当DNA(μg)和Lip2000(μL)的比例为1∶1.5时转染效率最高。本研究成功筛选出一种有效的鸡巨噬细胞HD11转染方法,为鸡巨噬细胞的转染及其相关研究提供了实验依据。     

真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP的构建及高效转染细胞的筛选

为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.0...     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P0.05;P0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

HSPB1基因对脂多糖诱导的鸡巨噬细胞炎症反应的调控机制

为了探究热休克因子结合蛋白1(heat shock factor binding protein 1,HSPB1)基因对脂多糖(LPS)诱导的鸡巨噬细胞(HD11细胞)炎症反应的调控机制，试验以不同浓度的LPS刺激HD11细胞不同时间，构建HD11细胞炎症模型，利用HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1瞬时转染HD11细胞后再用最佳浓度的LPS进行刺激，并以仅转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSPB1的HD11细胞为对照，采用实时荧光定量PCR方法检测转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后对白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和α干扰素(IFN-α)基因表达的影响。结果表明：在LPS浓度为1μg/mL、刺激时间为9 h时炎症因子IL-1β基因相对表达量极显著升高(P<0.01),成功构建出HD11细胞炎症模型；与转染pcDNA3.1质粒相比，转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后能极显著下调IL-6、IL-1β和IFN-α基因的相对表达量(P<0.01);受LPS刺激且仅转染pcDNA3.1...     

JSRV-Env重组质粒诱导转染TC-1、TC-1-Hyal2细胞后对TGF-α及VEGF因子表达的影响

通过脂质体法将JSRV-Env重组质粒瞬时转染小鼠肺上皮细胞(TC-1)和表达绵羊Hyal-2的小鼠肺上皮细胞(TC-1-Hyal2),而后探讨两细胞中转化生长因子-α(TGF-α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白表达的变化,以此分析TGF-α、VEGF与绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)发生的关联性及其在细胞癌变过程中的作用。体外培养TC-1和TC-1-Hyal2细胞,按照不同质粒可将TC-1和TC-1-Hyal2细胞分别设为pEGFP-C1-env转染组、pEGFP-C1转染组和未转染组。利用实时荧光定量PCR和ELISA方法对TGF-α、VEGF的表达水平进行检测。实时荧光定量PCR检测结果表明,相比对照组(pEGFP-C1转染组及未转染组),在转染pEGFP-C1-env的两细胞组中VEGF mRNA的表达量均显著升高(P0.05);而两细胞组中TGF-αmRNA的表达量均极显著升高(P0.01)。ELISA检测结果表明,同两对照组相比,转染pEGFP-C1-env的TC-1-Hyal2细胞上清液中VEGF、TGF-α蛋白浓度均极显著升高(P0.01);且VEGF在相同转染处理的TC-1细胞组中其蛋白浓度也极显著升高(P0.01),而TGF-α的蛋白浓度呈显著升高(P0.05)。比较pEGFP-C1转染和未转染各细胞组中TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量,结果均无显著差异(P0.05)。本研究发现,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测经JSRV-Env诱导转染上述两细胞系后TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量均升高,结果提示JSRV-Env可能上调两细胞因子,进而可推测TGF-α、VEGF的表达变化与OPA发病存在一定的关联性,由此为衍生出的OPA针对二者进行基因靶向治疗方案提供重要的理论依据。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.01),脂质体方法显著低于对照组(P0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

pEGFP-hTERT真核表达载体的构建及转染牛乳腺细胞方法的优化

针对牛乳腺细胞体外培养存活周期短、转染效率低等特点,分别采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶消化培养法及组织贴壁培养法,比较了牛乳腺细胞的生长、迁移、分化和凋亡等一系列特征.同时构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的端粒酶融合表达载体pEGFP-hTERT,采用脂质体分别转染两种真核表达载体pEGFP-hTERT、pEGFP-C1,通过比较载体不同浓度、传代细胞转染适合密度及生长活力、转染后的荧光强度等检测转染效率.结果表明,第3代细胞接种密度大约70%,浓度为350 ng/μL的载体适合于牛乳腺细胞的转染,转染效率大约为25%.试验结果为牛乳腺细胞体外转基因研究奠定了技术基础.     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

过表达MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。     

固醇调节元件结合蛋白基因的过表达对促进牛胎儿成纤维细胞脂肪形成的影响

为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿骨骼肌成纤维细胞培养48 h,实时荧光定量PCR和Western blotting分析目标基因表达水平的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果发现,pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染细胞内SREBP1 mRNA的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);SREBP1蛋白也出现明显上调;空白对照组和pEGFP-C1阴性对照组细胞内均未见有红染细胞,而pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染组中出现了清晰的红染细胞。说明SREBP1的表达可促进牛胎儿骨骼肌成纤维细胞脂肪合成,证实牛胎儿成纤维细胞中SREBP1表达和脂滴形成之间存在直接关系。     

电穿孔法转染水牛脂肪干细胞与成纤维细胞的研究

本研究以不同培养代数(P)水牛脂肪干细胞(buffalo adipose-derived stem cells,BASC)和成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs)为研究对象,采用电穿孔法对其进行转染,比较转染后细胞的相对存活率和转染效率,为生产高效转基因供体细胞奠定基础。以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,电转染48 h后观察荧光表达,收集细胞采用血细胞计数法和流式细胞仪分析细胞相对存活率和转染效率。结果表明:电转后的BASC和BFF表达EGFP,BASC相对存活率低于BFF,P10之前BFF存活率更稳定;BASC和BFF转染效率随培养代数增加出现不同程度的降低,P10之前BFF转染效率更稳定。电转技术可用于转染BASC和BFF,并获得较高的转染效率;使用体外培养早期代数的BASC(P8之前)和BFF(P10之前)可以获得更稳定转染效率的转基因细胞。     

RNA干扰大鼠H9c2心肌细胞Hsc70基因条件筛选

为了研究H9c2心肌细胞RNA干扰的转染条件,筛选结构型热休克蛋白70(Hsc70)干扰序列,采用流式细胞仪和Western blot方法,研究不同剂量比例荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)和不同浓度脂质体2000(Lipofectamine 2000)对转染效率的影响,进一步筛选Hsc70 siRNA的最佳沉默序列。结果显示:流式细胞仪试验得出的最佳转染条件为80 nmol/L FAM-siRNA+1.5μL Lipofectamine 2000;Western blot结果表明,Oligo 2、Oligo 3和Oligo 4组中的Hsc70蛋白表达极显著降低(P0.01),其中Oligo 3组的沉默效率最高;转染后48 h收获细胞为最佳转染时间。结果表明:80 nmol/L FAM-siRNA+1.5μL Lipofectamine 2000为最佳转染条件,以Oligo 3为最佳RNA干扰靶基因。     

MG132对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为了研究改变泛素化蛋白水平对牛骨骼肌卫星细胞体外增殖与成肌分化的影响,试验利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,采用1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132处理改变牛骨骼肌卫星细胞泛素化蛋白水平,同时设空白对照组和DMSO对照组,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞的密度,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞蛋白泛素化水平的变化,综合筛选MG132的最佳处理浓度;然后通过EdU增殖检测法检测MG132对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;最后通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyHC的表达情况,综合分析MG132对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。结果表明:牛骨骼肌卫星细胞经不同浓度MG132处理后,空白对照组和DMSO对照组之间细胞密度和蛋白泛素化水平没有明显变化,添加MG132后蛋白泛素化水平明显升高,随着添加浓度的增加对牛骨骼肌卫星细胞生长的抑制作用逐渐增强,综合分析选用1.25μmol/L的MG132进行细胞增殖和分化调控研究;经MG132处理后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率显著低于DMSO对照组(P0.05),诱导分化后的牛骨骼肌卫星细胞形成的肌管数量呈增多趋势,成肌分化标志因子MyHC的表达显著高于DMSO对照组(P0.05)。说明MG132可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进牛骨骼肌卫星细胞的分化。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素（MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖（DCN）为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2（si-DCN）转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期（GM）牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天（DM3）的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调（P<0.05;P<0.01）,且EdU阳性细胞率显著增加（P<0.05）,表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,MyHC在mRNA水平显著降低（P<0.05）,但在蛋白水平上极显著升高（P<0.01）,免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组（P<0.05）,说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

脂质体法转染山羊骨骼肌特异细胞条件的优化

试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。     

脂质体介导法转染体细胞效率的优化

为建立脂质体介导的高效体细胞转染体系,采用脂质体TransfastTM包裹编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pCMV-EGFP质粒,转染5～13代山羊胎儿成纤维细胞,并用流式细胞仪检测不同DNA剂量、细胞汇合度、血清、转染时间及脂质体与DNA比例等参数对转染效率的影响。实验发现0.75μgDNA按1∶1的脂质体与DNA比例,在无血清条件下转染汇合50%细胞3h,转染效率最高可达40.7%±5%。4h转染时间、细胞汇合80%及转染体系中有血清会降低转染效率。随着DNA剂量的增加,转染效率呈剂量依赖性增高,但山羊成纤维细胞的活细胞数显著下降。实验表明TransfastTM能高效安全地介导外源基因转染山羊成纤维细胞。