布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌（Brucella）感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩（Venn）分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低（P<0.01）;在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3'非翻译区（3'UTR）结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3'UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。     

羊种布氏杆菌介导巨噬细胞mmu-miR-146a-5p的差异表达及其靶基因的初步鉴定

羊种布氏杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)感染巨噬细胞后,运用高通量测序技术挖掘出mmu-miR-146a-5p差异表达。利用TargetScan和miRDB数据库分别进行mmu-miR-146a-5p靶基因的在线预测,结果分别有224和125个,利用韦恩分析发现,2个数据库的在线预测结果交集有70个;进一步利用PicTar数据库进行mmu-miR-146a-5p靶基因的在线预测,并与韦恩分析结果取交集;转染mmu-miR-146a-5p mimics至巨噬细胞中,通过荧光定量PCR方法检测预测靶基因的相对表达量,发现Ptpra与Tfdp2表达量显著降低,结果初步表明,mmu-miR-146a-5p的靶基因为Ptpra与Tfdp2。该试验为进一步研究mmu-miR-146a-5p在羊种布氏杆菌感染巨噬细胞过程中的作用奠定了基础。     

靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5p靶基因预测及验证

以辽宁绒山羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,用生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RTPCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Weston blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3′UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;TGF-βR1在皮肤毛囊不同发育时期无论在核酸水平还是蛋白水平均呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控TGF-βR1,从而对毛囊周期性发育起到调节作用。结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及TGFβR1在核酸水平表达规律和蛋白水平表达规律初步确定TGF-βR1为miR-1298-5p的靶基因。本实验旨在探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p与其靶基因的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

miR-194-5p靶向调控BCKDHA基因的表达

旨在预测并验证调控支链氨基酸分解代谢的限速酶支链α-酮酸脱氢酶复合体(Branched-chainα-ketoacid dehydrogenase complex,BCKDH)中α亚基即BCKDHA基因表达的关键miRNA。本研究利用3个在线软件预测与该基因具有靶标关系的miRNAs。利用荧光定量PCR检测小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中和超表达后关键miRNA与BCKDHA的表达量。结果表明,miR-194-5p是调控BCKDHA表达的一个关键miRNA,其种子序列与BCKDHA3′UTR第190~196位碱基完全互补。MiR-194-5p的表达随分化时间呈下降趋势,而BCKDHA mRNA则呈上升趋势。双荧光素酶报告结果也显示二者具有靶标关系,miR-194-5p下调BCKDHA的表达。超表达miR-194-5p后,BCKDHA的表达显著下调(P0.05)。由此证明,miR-194-5p通过与BCKDHA基因3′UTR结合抑制其表达。     

H1N1猪流感病毒介导小鼠 mmu-miR-206-3p下调及其对FN1表达过程的影响

为了分析H1N1猪流感病毒(SIV)介导小鼠mmu-miRNA-206-3p(mmu-miR-206-3p)下调及其对纤连蛋白1(FN1)表达过程的影响,试验选用10只6周龄雌性SPF级Balb/c小鼠建立感染H1N1 SIV小鼠模型,并将小鼠分为对照组和攻毒组,对照组用无病毒的尿囊液滴鼻,攻毒组用病毒尿囊液滴鼻,观察并记录小鼠的表现,利用RT-qPCR、Western-blot方法检测mmu-miR-206-3p、FN1和纤连蛋白1基因(Fn1)的变化。结果表明:感染H1N1 SIV 48 h后,对照组小鼠无异常表现,攻毒组小鼠精神萎靡,扎堆,食欲减退,被毛逆立。与对照组相比,12 h后攻毒组mmu-miR-206-3p相对表达量下降, FN1相对表达量升高,Fn1相对表达量变化不显著。说明H1N1 SIV可抑制mmu-miR-206-3p表达,减少mmu-miR-206-3p对Fn1翻译的抑制,进而导致FN1的相对表达量升高。     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

布鲁菌感染小鼠RAW264.7细胞对IRG1基因的表达调控作用

针对小鼠RAW264.7细胞IRG1基因设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRG1基因在RAW264.7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌16M株及M5株感染基因沉默细胞对IRG1基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRG1基因的表达,布鲁菌侵染RAW264.7细胞后IRG1基因表达上调。本试验为IRG1基因及相关调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。     

miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织差异表达分析及功能预测

利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织8个不同发育时期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)表达量,以了解其在动物睾丸发育及精子生成中的作用。利用miRanda、TargetScan和mirWalk 3个数据库预测miR-126-5p靶基因并取交集,利用David在线软件分析miR-126-5p靶基因的生物功能。结果表明,miR-126-5p在胚胎期(E90-D1)睾丸组织中高表达,而在生长期(D1-D90)表达量下调,但在沙子岭猪性成熟(D120)后表达量又上调,其中D1表达量最高,D90表达量最低,且二者与其他7个时期均差异极显著(P0.01);D30、E90、D180相互之间差异不显著(P0.05),且分别与其余各时期差异极显著(P0.01);D120与D30差异显著(P0.05),与其余各时期差异极显著(P0.01);D150与D60之间差异不显著(P0.05),二者分别与其余各时期差异极显著(P0.01)。miR-126-5p靶基因参与细胞增殖、凋亡、分化、细胞通讯、迁移及蛋白质转运等生物学过程(P0.001);靶基因分子功能包括蛋白二聚体活性、配体依赖性核受体活性(P0.001);KEGG分析显示miR-126-5p靶基因参与TGF-β、MAPK、细胞黏附等信号通路(P0.01)。结合miR-126-5p在睾丸组织不同发育时期表达差异结果及其靶基因功能预测结果,miR-126-5p可能参与沙子岭猪生殖细胞分化及精子生成调控,本研究为miR-126-5p在动物精子生中的作用及其调控机制的研究提供依据。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

鸡miRNA let-7b靶向调控GHR基因的双荧光素酶验证

miRNA是一类大小约为22 nt的内源性非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA相结合而影响其功能,进而调控动物的生长发育过程。miRNA靶基因预测软件发现,生长激素受体(GHR)基因是miRNA let-7b的候选靶基因之一。GHR基因作为生长激素基因的受体基因,在鸡的生长发育过程中具有极其重要的作用。试验采用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行验证。结果表明:GHR mRNA 3′UTR存在与let-7b相结合的靶标位点(UACCUCA);Let-7b过表达载体与GHR验证载体共转染组的荧光素酶相对活性只有0.159,明显下降,表明miRNA let-7b靶向负调控GHR 3′UTR,存在确切的靶标关系。研究结果可为进一步揭示let-7b介导GHR基因在鸡生长发育过程中的调控作用提供参考。     

细毛羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p靶基因预测及验证

为了探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,以细毛羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因FGF_2进行核酸水平相对定量检测,利用Western Blot对潜在靶基因FGF_2进行蛋白相对定量检测。生物信息学预测结果表明,FGF_2的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控FGF_2从而调控皮肤毛囊生长发育。表明结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及FGF_2在核酸水平表达规律和蛋白表达水平表达规律初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。     

miR-141-3P和miR-346在对靶基因FSHR的识别与验证

为探索miRNA-141-3P和miRNA-346在大鼠腺垂体中的靶基因,并对其进行识别与验证。本研究利用PCR方法,根据Fshr(Rattus)3′UTR野生型载体序列信息设计突变引物将靶序列CAGTGTT(78-85)突变为GTCACAA和GGCAGAC(127-133)突变为CCGTCTG,以野生型载体为模板PCR扩增Fshr基因的3′UTR突变序列,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中。由于miRNA是通过3′UTR区作用于靶基因,因此将miRNA与构建好的报告基因载体共转,通过报告基因相对荧光值的下调来印证miRNA与靶基因的相互作用。双荧光素酶报告基因表达分析显示,rno-miR-141-3p mimic对Fshr野生型载体的报告荧光没有明显下调作用;rnomiR-346mimic对Fshr野生型载体的报告荧光有明显下调作用,相应结合位点突变后,突变型载体中的报告荧光与野生型相比有所恢复;rno-miR-141-3p mimic和rno-miR-346mimic同时处理,对野生型载体的报告荧光有一定的下调作用。在体外,rno-miR-141-3p可能不能通过Fshr上相应的3UTR位点调控报告基因的表达;rno-miR-346有可能通过Fshr上相应的3′UTR位点调控报告基因的表达。本试验为FSHR的转录后调控研究提供了理论依据。     

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。     

乙型脑炎病毒感染小鼠原代神经元细胞的miRNA表达谱差异分析

研究乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染后小鼠原代神经元细胞miRNA的表达谱差异，初步探讨JEV与宿主在miRNA水平的相互作用。分别提取JEV感染48 h后的小鼠原代神经元细胞和未染毒组细胞，高通量测序分析miRNA的表达谱并进行差异分析，选取显著差异表达的miRNA进行实时定量PCR验证。结果筛选出26个差异表达显著的miRNA，其中，18个表达上调，8个表达下调。小鼠原代脑神经元细胞中mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p和mmu-miR-146a-5p的表达促进JEV-E基因在神经元细胞中表达，而mmu-miR-301a的表达抑制JEV-E基因的表达。神经元细胞中miRNA的表达影响JEV的复制，为进一步研究JEV致神经功能异常机制提供研究方向和理论支持。     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞差异表达miRNA和mRNA互作网络

旨在筛选猪圆环病毒2型感染猪肾上皮细胞(PK-15)后差异表达miRNA和mRNA,并探究miRNA和mRNA之间的互作关系。使用茎环定量PCR检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组之间的差异表达水平以发现差异表达miRNA,分析PCV2感染后第12小时的蛋白质组学研究结果(GEO登录号:GSE71945)以获得差异表达mRNA,并分析差异表达miRNA和mRNA之间的互相作用关系。结果显示,在PCV2感染后第12小时miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p等表达量显著性变化,使用miRecords预测其靶基因,分别发现7 105、9 741、7 451、7 183、7 971、8 793个靶基因;PCV2感染后第12小时共有158个差异表达mRNA,分属于多种细胞结构成分并参与多条重要的细胞生物途径,且差异miRNA的靶基因和差异mRNA之间有大量的交集基因。上述结果表明,PCV2感染能导致细胞内多种miRNA差异表达,造成miRNA的靶基因表达紊乱,进而影响细胞正常的生命进程。     

牦牛Nramp1基因mRNA组织表达谱及其相关miRNAs初步研究

旨在探究牦牛Nramp1基因mRNA及可能靶定Nramp1的miRNAs组织表达谱。本研究利用RT-PCR技术对牦牛Nramp1基因的mRNA组织表达谱进行分析,同时运用TargentScan和miRBase软件预测牦牛可能靶定Nramp1基因的miRNAs,并利用加PloyA尾法RT-PCR技术分析miRNAs在肝、脾、肺、肾、后腿骨骼肌、卵巢、小肠、颌下淋巴结、大肠、肠系淋巴结10种组织中的相对表达量。试验结果显示,Nramp1基因mRNA在所检测的10种组织中均有表达,其中在脾、颌下淋巴结及肺组织中的表达量极显著高于肝、肾、大肠、肠系淋巴结组织(P0.01),显著高于小肠组织表达量(P0.05)。预测到可能靶定牦牛Nramp1基因的miRNAs共有201个,从中选择6个进行表达谱分析,发现bta-miR-106a、bta-miR-20b、bta-miR-17-5p在牦牛免疫组织脾、颌下淋巴结、肠系淋巴结中,bta-miR-93、bta-miR-106b、bta-miR-20a在牦牛免疫组织颌下淋巴结、肠系淋巴结中均与Nramp1基因mRNA共表达,但是bta-miR-93、bta-miR-20a、bta-miR-106a、bta-miR-17-5p和bta-miR-20b在颌下淋巴结和肠系淋巴结间的表达量无显著差异(P0.05),而bta-miR-106a、bta-miR-20b在颌下淋巴结、肠系淋巴结组织中的表达量极显著高于脾组织表达量(P0.01), bta-miR-106b在颌下淋巴结组织中的表达量极显著高于肠系淋巴结组织表达量(P0.01)。Nramp1基因mRNA在牦牛体内广泛表达说明其可能具有广泛免疫调节作用;bta-miR-93、bta-miR-20b、bta-miR-106a、bta-miR-106b、bta-miR-20a和bta-miR-17-5p与Nramp1基因mRNA在免疫组织中的共表达表明二者可能具有靶向调控关系参与免疫调控作用,但二者是否存在真实的靶向调控以及其调控机制有待于深入研究。     

小鼠原始卵泡发育关键时期卵巢中miRNAs的生物学特征及功能分析

为了探究15.5胚龄和17.5胚龄小鼠卵巢中原始卵泡发育相关的miRNAs并解析其生物学功能，试验随机选用8～10周龄40只雌性和8只雄性健康小鼠进行饲养并合笼处理，提取小鼠原始卵泡发育关键时期15.5胚龄和17.5胚龄卵巢组织总RNA,PCR扩增筛选目的片段，高通量测序获得miRNAs,对其进行聚类、相关性、主成分和碱基偏好性分析，按照表达量倍数差异和表达差异显著性筛选差异表达miRNAs,对差异miRNAs进行靶基因预测，最后对获得的靶基因进行GO功能注释和KEGG富集分析。结果表明：经测序筛选共获得25个差异表达的miRNAs,其中上调的miRNAs有11个，下调的miRNAs有14个，差异倍数大于2且上调的miRNAs总共有5个，分别为mmu-miR-3471、mmu-miR-3472、mmu-miR-5132-3p、mmu-miR-3962及mmu-miR-7118-3p; 15.5胚龄和17.5胚龄的卵巢样品分别被聚集在两个区域，具有很好的一致性；miRNAs的长度不同，首位碱基的偏好性也不同；miRNAs在不同染色体上的碱基偏好程度也不一样；对筛选到的25个差异miRNA...