启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

重组山羊痘病毒通用转移载体的构建

为了便于山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)活载体疫苗的研究,本试验拟构建能够用于GPV重组的通用转移载体。用DNA合成和PCR方法构建含有启动子p7.5和p11的质粒pTKpp,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒pTKpp-GFP和通用转移质粒pTKpgigp,转染已感染GPV的羔羊睾丸(lamb testis,LT)细胞,观察GFP的表达情况;同时在pTKpgigp中插入外源基因FMDVVP1,构建重组转移质粒pTKpgigp-VP1,与GPV共转染LT细胞,产生并筛选重组GPV,验证外源基因的表达情况。结果显示,重组质粒中的启动子p7.5和p11能够启动GFP的表达;以重组转移质粒pTKpgigp-VP1进行的GPV重组成功获得了rGPV。最终证明通用转移载体pTKpgigp构建成功,能够用于重组GPV的相关研究。     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

羊痘病毒载体研究进展

羊痘病毒能引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病。羊痘病毒基因组较大,可容纳较大的外源基因。重组病毒载体是当今病毒基因工程研究的热点之一,目前以动物病毒为基础设计的基因克隆及表达载体主要有取代型的重组病毒载体和重组的病毒-质粒载体。作者综述了羊痘病毒载体构建策略和羊痘病毒活载体疫苗研究的最新进展。     

共表达口蹄疫病毒vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组山羊痘病毒的构建

将山羊IFN-γ基因插入到合有口蹄疫病毒（FMDV）vp1基因的山羊痘病毒（GPV）转移载体PTK-vp1中,获得合有FMDV vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组转移载体pTK-vp-IFNγ,以本实验室构建的表达β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的山羊痘重组病毒rAY41-LacZ为亲本毒,与转移载体pTK-vp-IFNγ共同转染犊牛睾丸细胞进行同源重组,通过7轮反向蓝白斑筛选,产生重组山羊痘病毒rAY41-VP-IFNγ,通过PCR和间接免疫荧光实验证实获得了能够稳定表达FMDV vp1和山羊IFN-γ的重组山羊痘病毒。     

鹅细小病毒VP3基因与鹅γ干扰素基因在重组禽痘病毒中的共表达

为了构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因与鹅IFNγ基因的重组禽痘病毒,本研究将GPV-VP3基因和鹅IFNγ基因克隆到禽痘病毒转移载体中,构建串联基因的禽痘病毒转移载体pSY-GoIFNγ-VP3,采用脂质体法将其转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑法筛选重组病毒,并进行8轮蚀斑纯化,以及PCR鉴定和间接免疫荧光(IFA)分析。结果表明,所获得的重组病毒rFPV-GoIFNγ-VP3能稳定表达外源基因。本研究为进一步开展GPV重组禽痘病毒疫苗的研制奠定了基础。     

羊痘病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因序列分析及其在鉴别病毒种属上的作用

为明确G蛋白偶联趋化因子受体(GpCR)基因在羊痘病毒种属鉴别中的作用,本实验对3株绵羊痘病毒(SPV)和2株山羊痘病毒(GPV)弱毒疫苗株的GpCR进行了克隆测序,并与GenBank中登录的21个羊痘病毒属成员相关序列进行了比对。核酸同源性分析表明SPV不同毒株之间同源性达到99.5%～99.8%;GPV之间同源性达到98.8%～99.8%;GenBank上公布的疙瘩皮肤病病毒(LSDV)之间同源性达到100%。而GPV、SPV和皮肤疙瘩病毒两两比对的同源性仅达到94.2%～95.9%。对GpCR的系统进化树分析可以看出GPV、SPV和LSDV分别位于不同的进化分枝上,而GPV与LSDV具有更近的亲缘关系。GpCR基因在鉴别GPV属和流行病学分析中具有重要价值。     

山羊痘病毒疫苗株和野毒株ORF121基因比较分析

山羊痘(goat pox,GP)是由山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)感染引起山羊的一种烈性传染病,弱毒疫苗接种是预防和控制GP的重要手段之一。ORF121是GPV编码和GPV转录、复制及细胞内包装相关的基因之一,在GPV突破宿主细胞免疫系统过程中扮演重要角色。为比较分析GPV疫苗弱毒株和野毒株编码的ORF121基因特征,本研究扩增并测定了GPV疫苗株和野毒株的ORF121基因序列,比较分析了二者核酸水平和氨基酸水平的变异及其蛋白质二、三级结构差异。结果表明,GPV疫苗弱毒株和野毒株编码的ORF121基因核苷酸序列相似性为97.9%,氨基酸序列相似性为98.2%。本研究结果为揭示GPV异原宿主致弱的机制积累了资料。     

Effect on Proliferation of Goat Pox Virus of TK Gene Deficiency

In this study, the proliferation of goat pox virus (GPV) was researched using the recombinant GPV of TK gene insertion inactivation. Different length DNA fragments X1, X2, X3 and X4 were inserted into the transfer plasmid pTKfpgigp to constructed the recombinant transfer plasmids and these plasmids were transfected into lamb testis cells infected GPV. Recombinant GPVs of TK gene inactivation by inserting foreign DNA fragment of 2 800, 4 000, 5 200 and 7 700 bp,respectively, were generated via homologous recombination. Four recombinant GPVs (rGPV/tk^-) were obtained by selective culture and the virus titer were mensurated by 50% tissue culture infective dose. The results showed that the rGPV/tk^- virus titers were decreased obviosuly which was comparable with the wild type GPV AV41. Furthermore, the virus titer of the recombinant virus was decreased more obviously with the extension of the foreign DNA fragment. The result indicated that the proliferation of the GPV was depressed when GPV TK gene was deficient.     

山羊痘病毒疫苗株ORF64～ORF67的分子特征

为构建胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因缺失活载体疫苗，对山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）疫苗株（AV41）ORF64-ORF67进行了克隆和序列分析。结果表明：在全长3460bp的DNA序列中，包含4个完整的开放阅读框（Open reading flame，ORF）。ORF64核苷酸序列全长396bp，编码病毒膜蛋白；ORF65核苷酸序列全长444bp，ORF64和ORF65有44个碱基重叠。ORF66核苷酸序列全长534bp，编码胸苷激酶，具有保守的ATP结合位点和细胞中TK特征序列。ORF67核苷酸序列全长594bp，编码宿主范围相关蛋白。ORF64-ORF66在脊索动物痘病毒亚科中是完全保守的。与参考的国外GPV进行序列比较，ORF64～ORF67有一些差异，如突变和插入等。同源性分析显示：与羊痘病毒属比较，核苷酸和氨基酸同源性均较高（94．7％～100％）。我国的GPV不同毒株TK同源性为100％。与脊索动物痘病毒亚科中其他成员同源性差异较大（17．3％～65．2％）。将GPV AV41TK与鸡、小鼠和人类的TK氨基酸序列进行比较，分析GPV AV41TK进化关系表明，GPVTK基因在进化上可能起源于宿主细胞的TK1基因。本研究结果显示，在分子水平上我国GPV AV41与国外毒株存在差异，推测可能是GPV AV41疫苗株在致弱过程中发生一定程度的变异。     

山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定

为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。     

山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎混合感染的检测与分析

利用特异性PCR方法从病山羊组织病料中分别扩增山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,继而将扩增的特异性片段克隆、测序,并与GenBank上相应的基因序列进行比对、绘制系统进化树,进行流行病学分析。结果表明,从病山羊中可同时扩增出山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,并通过基因序列比对分析确证了PCR检测结果,首次证实我国存在山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎的混合感染,为我国现阶段羊病的流行病学和有效防制措施的制定提供了参考依据。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

小鹅瘟病原学与检测方法的研究

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野生强毒.采用鹅胚增殖病毒,以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原;以感染鹅胚尿囊液人工接种5日龄健康雏鹅,复制出与自然感染病例相类似的病变; 通过电镜观察到典型的小鹅瘟病毒粒子.该分离毒株核酸分子量为5 000 bp.制备的小鹅瘟沉淀抗原可以检测患病雏鹅血清中的抗体,监测治疗血清的滴度和疫苗接种的效果.标记的小鹅瘟荧光抗体能直接检测患病雏鹅组织中的病毒抗原.针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物,扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段.     

小鹅瘟病毒的分离鉴定与临床病变观察

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野毒。采用鹅胚扩增病毒。以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原,用感染鹅胚尿囊液人工接种8日龄健康雏鹅,雏鹅表现出典型的小鹅瘟临床症状和剖检特征。     

吉林地区1株小鹅瘟病毒NS1和VP1基因的克隆与序列分析

为了解吉林地区小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的基因特征,及其与黑龙江及中国其他省份和国外流行毒株的相关性,本研究采用PCR方法鉴定2018年吉林某养鹅场送检的病死雏鹅的肠组织,同时对GPV的非结构蛋白NS1基因及结构蛋白VP1基因进行了克隆和测序,并与国内外16株GPV参考毒株的相应序列进行分析。结果表明,病死雏鹅为GPV与减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）混合感染;吉林地区GPV的NS1基因长为1 884 bp,编码627个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.8%~99.8%,氨基酸序列同源性为97.1%~99.7%;VP1基因长为2 199 bp,编码732个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.9%。NS1及VP1基因的系统进化树分析均表明,吉林地区GPV与哈尔滨分离株98E属于同一进化分支,亲缘关系最近,与国外分离株、中国台湾和安徽分离株亲缘关系均较远。吉林地区GPV与鹅源GPV具有较近的亲源关系,同源性明显高于其他水禽来源的GPV。该研究为明确中国东北地区GPV空间的流行规律提供基础数据,为东北地区GPV的诊断与治疗提供参考依据。