微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清的研制

为进一步完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库，改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺，本试验选取大肠杆菌O50、O60、O117、O131血清型进行定型血清制备方法的探究。首先用大肠杆菌不同血清型的参考菌株制备灭活抗原，而后多次免疫家兔以采血获得粗血清，用微量凝集试验的方法确定不同粗血清的交叉凝集素及凝集效价，再通过交叉凝集素吸收法结合血清稀释法消除非特异性凝集，最终研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清。本研究确定了大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型粗血清的主要交叉凝集素，最终成功研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清共4种，凝集效价在1：256至1：2 048之间，其中微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60定型血清无交叉凝集素，为单因子定型血清，微量凝集试验用大肠杆菌O117、O131定型血清存在1~2种非特异性的交叉凝集素O14和O107。本研究作为大肠杆菌O抗原定型血清制备工艺摸索过程中的重要部分，为完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库，进一步改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法提供了重要理论依据。     

大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清的制备

为研制大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了定型原血清,并通过比较不同免疫程序及剂量优化了定型原血清的制备工艺。进而按照优化后的定型原血清制备工艺,以大肠杆菌参考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了10种O抗原型定型原血清。将定型原血清分别与180种微量凝集试验抗原逐一反应,明确各原血清与非特异性抗原的交叉凝集价,通过用吸收抗原对原血清进行吸收及稀释的方法消除非特异性凝集,最终制备成大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清。血清质量评价结果表明,新制备的单因子定型血清性状为无色、淡黄色或黄色澄明液体,个别有少量絮状物;无菌生长;特异性良好;凝集效价为1︰2。研究结果显示,制备的大肠杆菌O抗原单因子定型血清具有较好的特异性,可以用于对临床分离大肠杆菌进行O抗原血清型鉴定。     

5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备

本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种制备免疫抗原并免疫家兔,获得5种大肠杆菌O抗原定型原血清,而后制备多种吸收抗原以消除5种原血清的非特异性凝集素。通过微量凝集试验的方法,确定各血清的凝集价。最终确定了5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法,为进一步改进大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺提供了思路和依据。     

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种,经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明,当菌液调整至OD600 nm值为0.147±0.026时,各型抗原的浓度为1×109CFU/m L,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原,3批抗原与血清的凝集价均分别一致,分别达到211(O2)、212(O7)及29(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测,制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应,与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有较好的稳定性及特异性,可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。     

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种,经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明,当菌液调整至OD_(600 nm)值为0.147±0.026时,各型抗原的浓度为1×10~9CFU/m L,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原,3批抗原与血清的凝集价均分别一致,分别达到2~(11)(O2)、2~(12)(O7)及2~9(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测,制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应,与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有较好的稳定性及特异性,可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。     

布鲁氏菌A、M因子血清的研制

研制牛种布鲁氏菌A因子血清和羊种布鲁氏菌M因子血清,用于光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。将灭活牛种布鲁氏菌2308株及羊种布鲁氏菌16M株免疫1.5~2 kg家兔各5只制备高免血清。对高免血清采用抗原交叉吸附的方法,制得A、M因子血清,分装冻干后置-20℃保存。微量试管凝集试验结果显示:研制的A因子血清对16M抗原在1∶2.5时无凝集现象,对2308抗原凝集价为1∶320;研制的M因子血清对2308抗原在1∶2.5时无凝集现象,对16M抗原凝集价为1∶160。玻片凝集试验结果显示:研制的A、M因子血清对异种抗原无凝集现象。试验表明,研制的A、M因子血清具有特异性强、效价高的特点,可辅助光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。     

用3种分型方法研究鸭疫里默氏菌的血清型

用玻片凝集试验、试管凝集试验和琼脂扩散沉淀试验3种方法，检测了鸭疫里默氏菌的19个参考菌株和部分分离株与同型和异型抗血清的反应。结果表明，3种分型方法具有很好的相关性，但在检测异型菌株之间的交叉反应时表现出不同。玻片凝集试验适于对大量分离株的快速筛选，但不能作出准确定型。以各型参考菌株为参照，根据试管凝集试验可将被检菌株分型，但当分离株与一个以上血清型的抗血清产生差异较小的凝集效价时，则难以定型。琼扩试验也适合于对分离株进行进一步检测，但要求制备较高效价的抗血清。对血清进行吸收可消除3种分型试验中的所有交叉反应，并制备出单因子血清。但这些单因子血清只是相对于已知血清型具有特异性，某些分离株虽然只与某型单因子血清发生凝集反应，仍可能属于新的血清型或某个已知型的亚型。     

大肠杆菌O26、O45、O121血清型多重PCR检测方法的建立及应用

大肠杆菌O26、O45、O121血清群是STEC中的常见血清群,传统的大肠杆菌血清学检测存在费时、费力而且不同血清型之间经常出现免疫交叉反应,这给大肠杆菌血清学鉴定带来了极大的困扰。本研究根据大肠杆菌O抗原决定簇相关基因之间的差异设计合成了3对引物,能够快速而准确的鉴定这3种血清群,建立的方法具有较高的特异性、灵敏性,其最低检测灵敏度可达到10pg细菌基因组DNA。     

微量凝集试验对鸡大肠杆菌O抗原血清型鉴定的研究及初步应用

为改进大肠杆菌血清型鉴定方法,用５株标准菌株在９６孔Ｕ型板上进行微量凝集试验,优选了反应及观察条件：每孔中加５０μＬ菌体抗原（浓度为１．５×１０９－２．０×１０９个菌／ｍＬ）和５０μＬＯ抗原单因子血清（稀释度从１／１０－１／８０）混合,于３７℃反应１．５－２ｈ,阳性结果可在黑色背景上清晰观察到片状凝集。试验各株均与原血清型一致。用此法对１７株来自山东某地的鸡大肠杆菌进行了血清型鉴定,结果Ｏ７８为５株,Ｏ３６５株,Ｏ１３１４株,Ｏ７０３株,与以前用常规方法对该地区菌型鉴定结果相符。     

副猪嗜血杆菌多价平板凝集抗原的研制

为了建立副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)平板凝集抗体检测方法,试验采用方阵试验方法对15种HPS菌体抗原和阳性血清的交叉凝集反应性进行了研究,从中筛选出能与所有血清型HPS血清发生凝集反应的多价抗原,并测定其特异性。结果表明:各血清型HPS抗原抗体之间均存在不同程度的交叉凝集反应,但没有任何一种血清型的HPS能与全部15种血清型抗体发生凝集反应,由各血清型的交叉凝集谱可见,血清1型、6型、7型等三个血清型抗原能覆盖全部15个血清型抗体,据此选择这三个菌株作为多价抗原生产菌株。将其接种于含NAD的TSA平板上,于37℃培养18 h,用pH值为7.2的PBS洗下菌苔并将菌液浓度分别调整至8×10~9cfu/m L,三种菌液用甲醛灭活后等体积混合即为HPS平板凝集多价凝集原,其能与15个血清型HPS抗体发生75%及以上的凝集反应,能凝集HPS的感染抗体和免疫抗体,不与猪传染性胸膜肺炎等被检的无关疫病的阳性血清发生反应。说明试验制备的多价平板凝集抗原能用于HPS抗体的检测和血清流行病学调查。     

大肠杆菌O8、O9和O89血清型三重PCR检测方法的建立

为建立一种快速鉴定O8、O9和O89血清型大肠杆菌的三重PCR方法，根据GenBank登录的3种血清型大肠杆菌O抗原合成基因簇序列，设计3对检测引物，通过优化反应条件建立三重PCR方法。结果：经条件优化后的三重PCR方法可有效鉴别O8、O9和O89血清型的大肠杆菌，具有良好的特异性，对其他肉羊养殖场常见血清型的大肠杆菌和致病菌无特异扩增条带；敏感性检测显示，三重PCR方法对O8和O89血清型的最小检出量为10 pg/μL,对O9血清型的最小检出量为100 pg/μL;采用该方法对临床分离的大肠杆菌进行检测，结果与传统血清凝集方法一致。综上，本研究建立的三重PCR方法可快速、准确、特异地对O8、O9和O89血清型大肠杆菌进行检测，为养殖及肉品加工环节大肠杆菌的流行病学研究提供了更加快捷的检测手段。     

多株猪源大肠杆菌结构抗原和分泌抗原的研究

选取6株(300、303、316、325、327和343)猪源大肠杆菌免疫家兔制备高免血清,与6株菌的全菌抗原、菌体(O)抗原、渗透因子及外膜蛋白抗原分别进行交叉凝集试验和琼脂扩散试验。结果表明,大肠杆菌的主要抗原为O抗原,其中300和303 2株菌的抗体与其他4株菌的抗原具有广泛的交叉性。     

大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

鸭疫里默氏菌6型、12型与16型之间的交叉反应

鸭疫里默氏菌6型和12型仅在玻片凝集试验中存在较弱的交叉反应，这一交叉反应可经血清吸收试验得到消除；12型和16型在玻片凝集试验和试管凝集试验中均表现较强的双向交叉反应，但在琼扩试验中表现为较弱的单向交叉反应；6型和16型之间没有交叉反应。12型和16型之间的交叉反应和交叉沉淀反应均可经血清吸收后得以消除，但经过16型参考菌株吸收过的12型抗血清，还与6型菌株存在交叉凝集反应，只有同时用6型和16型菌株吸收，12型抗血清才具有血清型特异性。血清吸收对6型和12型抗血清的同型凝集反应能力和沉淀反应能力没有影响，但对16型抗血清的同源凝集能力和沉淀反应能力均有较大的影响，经、2型参考菌株吸收后，16型抗血清与同型抗原之间的凝集效价下降2个滴度，而且不再形成清晰的沉淀线。结果表明，6型和12型之间、12型和16型之间均存在ab-bc的抗原关系。     

几个鸡场大肠杆菌自家苗的研制及应用效果观察

禽大肠杆菌病的病原为大肠埃希氏杆菌，其血清型极多，其中菌体抗原（0）171种，荚膜抗原（K）103种，鞭毛抗原（H）56种，这些抗原可组合成大量抗原性不同的血清型。刘秀梵等从我国18个省、市、自治区分离}}{440株禽源性大肠杆菌，经鉴定有60个血清型之多．而且不同地区的优势血清群差异很大，且与国外报道的优势血清群为O1、O2、O35、O78并不完全相一致。国外家禽大肠杆菌病主要是由这4种血清型所致．很少分离到其他致病性血清型．而国内不同地区都有其独立的优势血清群，就是在同一地区不同养殖场血清型相差也较大，甚至在同一鸡场同一鸡群可以存在多个血清型。不同血清型之间的抗原交叉保护力较弱．不可能制备一种覆盖所有血清型的超广谱疫苗。我国不同地区的优势血清群的差异也不能像国外那样通过开发包括优势血清群抗原的疫苗就可以达到理想的免疫效果。因此，家禽大肠杆菌疫苗在我国应用存在较大的局限性。     

鸡大肠杆菌改良微量凝集试验抗原的制备及试验条件优化

本研究对微量凝集试验进行了改良,改进了抗原的制备方法,优选了检测鸡血清中大肠杆菌抗体的微量凝集试验的条件,经方阵试验,抗原最适浓度为70亿/ml,反应最适温度为37℃,最适反应时间为4～5h.结果表明改良后的微量凝集试验具有良好的敏感性和特异性,阳性结果和凝集图案清晰,易于观察.本试验具有敏感、特异、快速、简便、定性又定量的特点,便于推广应用.     

鸡大肠杆菌病病原菌的分离与鉴定

从山西省的10个地市肉鸡场采集52份疑似大肠杆菌病料进行细菌的分离和生化鉴定,分离到大肠杆菌49株。应用微量平板凝集试验,对分离的49株致病菌进行了血清型鉴定,鉴定出42株共有11种血清型,其中以O2、O78、O1、O74、O11血清型最多,占能定型分离致病菌株的75.9%。     

肉鸡大肠杆菌病病原菌的分离鉴定

从山西省的10个地市肉鸡场采集52份疑似大肠杆菌病料进行细菌的分离和生化鉴定,分离到大肠杆菌49株.应用微量平板凝集试验,对分离的49株致病菌进行了血清型鉴定,鉴定出42株共有11种血清型,其中以O2、O78、O1、O74、O11血清型最多,占能定型分离致病菌株的75.9%.     

肉鸡大肠杆菌病病原菌的分离鉴定

从山西省的10个地市肉鸡场采集52份疑似大肠杆菌病料进行细菌的分离和生化鉴定,分离到大肠杆菌49株。应用微量平板凝集试验,对分离的49株致病菌进行了血清型鉴定,鉴定出42株共有11种血清型,其中以O2、O78、O1、O74、O11血清型最多,占能定型分离致病菌株的75．9％。     

母猪初乳中的抗菌抗体

用埃希氏大肠杆菌血清型(O_6,O_(45),O_(81),O_(83),O_(115),O_(138),O_(139)和O_(126)),鼠伤寒沙门氏杆菌和猪霍乱沙门氏杆菌的O凝集素试验,测定了138份母猪初乳样品中抗细菌抗体的活性。埃希氏大肠杆菌O_(83)的凝集素效价平均最高,埃希氏大肠杆菌O_(115)次之。猪霍乱沙门氏杆菌的凝集素效价平均最低,鼠伤寒沙门氏杆菌次之。这些O凝集素效价之间的相关系数是在0.109和0.693之间。鼠伤寒沙门氏杆菌的相关系数量低,埃希氏大肠杆菌O_(83)、O_(138)和猪霍乱沙门氏杆菌也是低的。利用主成份分析,它能把10类O凝集素归为四个组,这四个组主成份的累积比例占总方差的77.97％。这些O凝集素的因子载荷(factor loading)累积系数是从65.25％到99.50％。断乳仔猪是从感染母猪的初乳中获得保护的,母猪抗细菌抗体的种类和范围,影响着仔猪的死亡率,其变化随母猪的变化而变化,依靠母猪抗原的暴露。大肠杆菌病和沙门氏杆菌病,在猪中是经常见到的。主成份析,对于评价农场喂养的母猪初乳中抗O凝集素的这些细菌的分布和范围,对于了解大肠杆菌病和沙门氏杆菌病的发生都是必要的。这些O凝集素效价范围,将揭示出埃希氏大肠杆菌的血清型和沙门氏杆菌属细菌在农场中的分布。本研究的目的,是利用从腹泻猪分离出的三个Ecoli血清型,从水肿病猪分离出的三个Ecoli血清型,两个对照Ecoli血清型和两株沙门氏杆菌属细菌,来检测O凝集素的效价。