葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

可可毛色二孢效应子LT_397基因的克隆及转录分析

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae是引起葡萄溃疡病的主要致病菌之一。病原菌会分泌许多效应子抑制植物的防御反应。本试验对可可毛色二孢特有的效应子LT_397基因进行克隆,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1140 bp,含有11个半胱氨酸。生物信息学软件预测显示:效应子LT_397信号肽为位于N端的1~16个氨基酸。qRT-PCR结果表明:LT_397受可可毛色二孢诱导下,在侵染24 h的基因相对转录水平最高;在逆境胁迫处理方面:LT_397在营养、氧化、离子、酸碱和UV胁迫下基因的相对转录水平都上升。烟草瞬时表达表明,效应子LT_397可抑制水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引发的过敏反应(hypersensitive response,HR)。以上结果为进一步分析效应子对寄主的致病机制奠定了基础。     

球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因分析

本文研究球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因,为提高球孢白僵菌的致病力提供基因靶点,从而提高球孢白僵菌对小菜蛾的防治效果。通过室内生物测定,筛选出球孢白僵菌对小菜蛾的高毒力菌株;采用新一代Solexa高通量测序技术对纯培养的球孢白僵菌和球孢白僵菌侵染小菜蛾48 h的虫菌混合样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学方法分析差异表达基因涉及的基因功能及细胞通路等;应用荧光定量PCR技术验证20个基因的差异表达。转录组测序结果显示,纯培养的球孢白僵菌与侵染小菜蛾幼虫48 h的球孢白僵菌转录组对比分析共得到8383个差异表达基因,其中显著差异表达基因716个,上调基因350个,下调基因366个。本研究筛选获得的差异表达基因,特别是上调表达的基因可能与球孢白僵菌对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类表明,DEGs被注释到26个GO term中,包括11个生物学过程,8个细胞组分和7个分子功能;Pathway分析表明共有12个Pathway,93个上调基因和61个下调基因参与了这些途径。深入分析发现,胞外丝氨酸富集蛋白、细胞壁蛋白、胞外双加氧酶、铁转运蛋白、细胞壁半乳糖抗原蛋白等在侵染过程中与毒力相关的基因均具有显著性差异表达。研究结果为阐明球孢白僵菌对小菜蛾的侵染机制提供了基础。     

一种由可可毛色二孢引起的春芋新病害

正可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae(Pat.) GriffonMaubl.)是由Griffon和Maublanc~([1])在对Botryodiplodia theobromae进行订正的基础上而确立,Alves等~([2])于2008年对这个种又进行了研究并补充了DNA序列信息。可可毛色二孢是一种重要的病原菌,可引起多种植物的枯萎、根腐及焦枯等病害症状~([3,4])。而假可可毛色二     

线粒体羧酸盐转运蛋白BcMito-TTP参与灰葡萄孢致病、产孢及菌核发育的研究

 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)可侵染1 400多种植物,给全世界农作物生产造成了严重的损害。BcMito-TTP蛋白是一种进化保守的线粒体羧酸盐转运蛋白,酿酒酵母中研究发现该羧酸盐转运蛋白主要负责催化柠檬酸盐通过线粒体内膜流出以交换羧酸盐H⁺离子等。本研究通过对BcMito-TTP基因进行敲除和功能互补发现,与原始菌株相比,敲除转化子生长速度没有差异,但产孢量有所降低,致病力明显减弱,菌核形成进程推迟。BcMito-TTP敲除转化子在添加CH₃COONa培养基中生长速度变慢且将BcMito-TTP基因互补可以恢复上述生物学性状。推测BcMito-TTP蛋白的缺失阻碍了CH₃COONa在灰葡萄孢体内的运输继而影响其孢子和菌核的形成,BcMito-TTP 基因参与灰葡萄孢致病力分子机制正在进一步研究之中。     

甘蔗NBS-LRR类抗梢腐病基因的筛选及定量表达分析

本文旨在探讨核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复(NBS-LRR)类基因参与甘蔗抗梢腐病菌侵染应答机制,为后续克隆关键抗病基因以及研究抗病机理提供理论依据。试验利用Illumina高通量转录组测序技术检测高抗梢腐病品种‘粤糖94-128’和高感梢腐病品种‘桂糖37号’接种前后NBS-LRR类抗梢腐病基因的表达情况,然后设计引物对显著差异表达基因进行不同接种时期下的荧光定量PCR验证。结果表明,16个NBS-LRR类基因在甘蔗叶片受到梢腐病菌侵染后持续上调表达,但表达趋势存在两种情况,13个基因在诱导后7 d显著或极显著上调表达,3个基因在诱导7 d后上调表达不显著,在诱导14 d后才显著上调表达。据此可将其分为瞬时基础防御基因(0~7 d)和滞后特异性防御基因(14~21 d),确定NBS-LRR类基因参与甘蔗防御梢腐病菌的侵染。     

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。     

梨品种‘玉露香’抗火疫病蛋白质组学分析

由解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora引起的火疫病是一种重要的经济病害,严重影响着全球苹果和梨的生产。E. amylovora 被列为我国重要的检疫性有害生物。然而,植物抗火疫病分子机制尚不够明确。本研究鉴定了梨品种‘玉露香’对 E. amylovora 的抗性,开展了抗性相关蛋白质组学分析。嫩枝穿刺接种分析结果表明,‘玉露香’对 E. amylovora 表现出明显早期抗性。采用高通量蛋白组学分析技术,鉴定获得‘玉露香’和感病品种‘库尔勒香梨’的差异表达蛋白192个,其中包括29个抗病和防卫相关蛋白,13个氧化还原相关蛋白以及1个铜离子转运ATP酶蛋白HMA5。抑菌动态分析结果显示,2 mmol/L Cu2+完全抑制E. amylovora 的生长。本研究为进一步揭示梨火疫病抗性分子机制提供了候选基因。     

灰葡萄孢蛋白激发子BcGs1诱导番茄抗病性及功能结构域鉴定

病原菌与植物互作过程中分泌的细胞壁降解酶具有致病和激发植物免疫的双重功能。BcGs1是从灰葡萄孢菌代谢物中分离的葡聚糖-1,4-α糖苷酶,能激发番茄和烟草的免疫防御反应,提高抗病性。BcGs1包含糖苷水解酶家族15(GH15)和糖结合模块家族20(CBM20)两个结构域,其激发植物防御反应的作用方式及功能结构域尚不清楚。本文测定了BcGs1不同诱导时间对提高番茄抗灰葡萄孢菌的效果、体外糖苷酶活性,并比较了BcGs1不同结构域截短蛋白与全长蛋白引起细胞坏死活性的差异。结果表明,BcGs1蛋白诱导番茄72 h可将灰葡萄孢菌引起的病斑面积减少23.25%;BcGs1能水解淀粉和海带多糖,但不能水解羟甲基纤维素和微晶纤维素;BcGs1全长、GH15和CBM20截短蛋白均能在烟草细胞中正常瞬时表达,但表达GH15的烟草叶片枯斑面积明显小于表达全长蛋白BcGs1的枯斑面积,表达CBM20截短蛋白的叶片没有产生枯斑反应;为了进一步明确截短蛋白GH15和全长蛋白BcGs1激发烟草细胞坏死活性的差异,用大肠杆菌表达并获得了纯化的重组蛋白GH15,叶片浸润法测定结果表明,截断蛋白GH15的细胞坏死活性仍然低于BcGs1全长蛋白的坏死活性,说明BcGs1诱导烟草细胞坏死活性需要GH15和CBM20结构域的共同参与。本文研究结果为进一步探讨BcGs1诱导植物抗病机制奠定了基础。     

丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达

丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan是粉虱类害虫的重要寄生性天敌昆虫，补充糖分等营养可以延长丽蚜小蜂寿命及增加其产卵量，但对其糖转运相关蛋白基因及其糖诱导表达尚不清楚。本研究克隆获得丽蚜小蜂的糖转运蛋白EfST1基因，与其他寄生蜂的糖转运蛋白基因序列同源性达65%以上；进一步采用实时荧光定量qPCR技术检测发现，饲喂不同浓度的葡萄糖溶液均可显著提高EfST1基因的表达量，且饲喂不同时间段（2～48 h）后，丽蚜小蜂EfST1基因表达量均显著高于对照组，2 h和48 h处理组间差异不显著。综上，EfST1基因可能与糖分补充及其转运密切相关，该基因诱导表达受糖分浓度影响小。研究结果为进一步研究寄生蜂生物防治过程中补充营养及其转运机制奠定基础。     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

In situ bioremediation of organochlorine‐pesticide‐contaminated microcosm soil and evaluation by gene probe

BACKGROUND: Pesticide‐formulating industries are contaminating the environment through various activities. Bioremediation is the best method for decontamination, as chemical and physical methods are not only costly but also not very effective in open field systems. In the present study, in situ bioremediation of organochlorine‐contaminated soil was demonstrated by combined biostimulation and bioaugmentation strategies, followed by evaluation using a molecular method. RESULTS: Three parameters were monitored: microbial biomass (colony‐forming units (CFU) g^?1 soil), residual pesticides after treatment and catabolic genes from microcosm soil. Both the biostimulation and the bioaugmentation treatments showed an initial lag phase of 80 days towards colony‐forming units. Gas chromatography of soil samples showed that concentrations of residual pesticides in the soil declined by up to 85–90% after 80 days, indicating their utilisation with time. On dot‐blot hybridisation of the total DNA from the same soil samples, it was observed that catabolic genes tfdC (catechol 1,2‐dioxygenase) and cm genes (chlorophenol monoxygenase) were predominant, whereas other catabolic genes such as catechol 2,3‐dioxygenase (xylE) were negligible. CONCLUSION: The strategy of in situ bioremediation and its evaluation by gene probe and also by conventional methods was demonstrated for organochlorine‐pesticide‐contaminated soil in open microcosms. It showed that bioaugmentation along with biostimulation was effective, although initial acclimatisation for a period of almost 2–3 months was required in the open field systems. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

Genetic and molecular analyses of the incompatibility between Lolium isolates of Pyricularia oryzae and wheat

Pyricularia oryzae isolates from Lolium spp. (annual ryegrass and perennial ryegrass) show evidence of recent events in evolution of this fungus. A wheat blast isolate found in Kentucky in 2011 was assumed to originate from annual ryegrass isolates. Genetic analyses revealed that the incompatibility between a Lolium isolate and common wheat cultivars is controlled by two gene pairs, Rmg6–A1 with a strong effect and R2-A2 with a weak effect, implying that this incompatibility is conditioned by simple gene-for-gene interactions. Disruption of the A1 avirulence gene led the Lolium isolate to gain virulence on common wheat. These results suggest a mechanism for host jumping by the blast fungus.     

瓜类果斑病菌致病基因及靶标基因的预测

哈密瓜果斑病是严重危害瓜类的种传细菌性病害,其病原菌为嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。本文首先用Bioedit软件建立瓜类果斑病菌全氨基酸序列本地资源库,运用比较基因组学的方法,通过大量查找嗜酸菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、木质部小菌属中的致病基因和参考文献中已报道的致病基因,下载相关致病基因的氨基酸序列,与瓜类果斑病菌的全氨基酸序列进行localblast,取E<10-5的为候选基因,得到果斑病菌中与致病性相关的基因,并对未知蛋白进行产物预测。同时,根据已经公布的靶标基因,用同样的比对方法,得到果斑病菌中潜在的靶标基因。本研究通过保守估计,得到77个致病性相关蛋白,预测了其中7个未知蛋白的产物,得到46个靶标蛋白。致病基因和靶标基因的分析预测,对以后研究此类基因提供了指导作用,为更好地防治该病害提供了理论基础。     

蝉棒束孢交配型基因的分析和检测

蝉棒束孢Isaria cicadae为药用真菌蝉花的无性型,在防治同翅目害虫上具有重要作用。在自然状态下蝉棒束孢多以孢梗束状态存在,其子实体阶段极为少见。交配系统是真菌有性生殖过程中的决定因素,因此可从交配型的角度探究蝉棒束孢有性子实体稀少的原因。本研究运用RACE技术首次从蝉棒束孢中克隆出MAT1-1-1与MAT1-2-1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。根据cDNA序列设计并优化得到蝉棒束孢交配型鉴定引物,并对采集自安徽地区40株蝉棒束孢交配型进行鉴定,结果表明交配型MAT1-1菌株14株、MAT1-2菌株26株,并没有检测到同时含有两种交配型或两种交配型全部缺失的现象,因此蝉棒束孢有性型子实体几无发生的现象并不完全归因于交配型因素。     

小麦对小麦孢囊线虫抗病性研究进展

 由小麦孢囊线虫引起的小麦孢囊线虫病发生分布范围广,防治困难,严重危害我国小麦生产。在我国危害小麦的孢囊线虫主要包括禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)和菲利普孢囊线虫(H. filipjevi)。种植抗病小麦品种是防治小麦孢囊线虫病最经济有效的措施,近10年来,我国科学家制定了小麦孢囊线虫抗性评价标准,测试了我国主推小麦品种和部分引进种质资源对小麦孢囊线虫的抗感性,鉴定到太空6号、新麦11、VP1620和Madsen等抗小麦孢囊线虫的优良材料,利用抗源创制了一系列的抗小麦孢囊线虫种质材料,从组织细胞学、基因组和转录组等解析了小麦抗孢囊线虫的机制。本文主要从小麦孢囊线虫致病型分化、抗性评价、抗性基因鉴定、抗性机制解析和抗病基因利用等方面进行综述。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

柑橘绿霉病菌木聚糖酶基因(PdXY2)功能初步研究

柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)是引起柑橘储藏期腐烂最主要的病原之一,严重影响了柑橘产业发展。本试验克隆了柑橘绿霉病菌的木聚糖酶基因(PdXY2),对其表达进行研究,在柑橘发病过程中,PdXY2的表达显著升高,至48h达到最高,其表达量为对照的4倍。为进一步明确PdXY2基因功能,构建了PdXY2基因缺失突变株(ΔPdXY2),ΔPdXY2突变株的致病性与野生型相比没有明显差异。由此我们推断,在柑橘绿霉病菌侵染柑橘的过程中PdXY2有一定的作用,但是单一缺失木聚糖酶PdXY2基因不能影响其致病性。