鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

鞭毛素蛋白FliCaaa诱导水稻免疫反应的活性测定

为阐明燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)鞭毛素蛋白Fli Caaa及其结构域对水稻免疫反应的诱导作用,通过分子生物学和生物信息学方法,对Aaa菌株IPN1的鞭毛素进行基因克隆及其序列分析;在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端片段进行了原核表达,纯化了Fli Caaa蛋白及其截短肽段;采用水稻叶片浸润法测定了表达蛋白对水稻免疫反应的诱导活性。结果表明,通过特异性引物的PCR扩增,获得1 479 bp的鞭毛素基因fli Caaa,其编码产物含有492个氨基酸,分子量为49.4 k D,具有flagellin-N和-C两个保守结构域;原核诱导表达获得了Fli Caaa、Fli Caaa-N和Fli Caaa-C可溶性融合蛋白;3种纯化蛋白均能诱导水稻细胞死亡和H2O2产生等免疫反应,但诱导能力略有差异。     

激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性

 激活蛋白PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离的,能诱导植物产生系统获得抗性的蛋白激发子。为了阐明PeaT1诱导植物提高抗性的分子机制,本文采用RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草悬浮细胞后不同时间PR-1a基因的转录活性,在烟草悬浮细胞中加入20μg/mL的PeaT18h后,PR-1a基因转录活性达到最高;相同浓度的PeaT1处理烟草植株,烟草叶片中酸性PR蛋白表达量升高。激光共聚焦显微镜观察到FITC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合;使用共价交联剂BS³证明¹²⁵I-PeaT1可与烟草细胞质膜上的2个分子结合,而与加热或蛋白酶处理的质膜不能发生交联,说明与PeaT1结合的分子具有蛋白特性,分子量分别为20kDa和30kDa。上述实验结果证明在烟草细胞质膜上存在着激发子PeaT1受体样的结合位点。     

互作蛋白Nbnrp1参与真菌蛋白激发子PevD1诱导烟草抗病性的功能研究

Pev D1是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌的蛋白激发子,能引起烟草细胞坏死、免疫防御反应和系统抗病性。本实验室前期鉴定了Pev D1的一个互作蛋白Nbnrp1,本研究在此基础上,分析了Nbnrp1在烟草中的表达特征及其亚细胞定位。用RNAi技术获得了Nbnrp1基因沉默株,研究了互作蛋白Nbnrp1在Pev D1诱导烟草抗病性中的功能。结果表明,Nbnrp1在烟草根、茎和叶以及不同生长发育阶段均有表达,定位在烟草细胞核和细胞质中。与野生型植株比较,Nbnrp1沉默植株对Pev D1诱导的细胞坏死反应的程度降低,抗病性减弱,抗病基因PR1-a,PR1-b转录表达水平降低,说明Nbnrp1蛋白参与了蛋白激发子Pev D1诱导的烟草免疫反应和系统抗病性。研究结果为进一步揭示Pev D1诱导烟草抗病机制以及大丽轮枝菌与寄主互作机制奠定了基础。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

棉疫病菌90kD胞外蛋白激发子诱导烟草过敏性反应的研究

 就棉疫病菌90 kD胞外蛋白激发子诱导烟草过敏反应(HR)过程中细胞死亡和防卫反应酶系活性变化及病程相关蛋白PR5的诱导进行研究。结果是,以10 nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片,HR枯斑周围5 mm宽组织在UV光下呈现蓝色荧光,对处理部位进行Evans blue染色测定结果是至20 h处理部位细胞全部死亡;激发子可诱导烟草防卫反应中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性提高;可快速诱导PR5基因的转录。上述结果表明90 kD蛋白激发子可诱发烟草的细胞死亡、苯丙烷代谢和PR基因的表达等多条信号途径。     

淡紫拟青霉QLP12对感染灰霉病后番茄植株的促生作用及抗病相关酶活性变化

为探究淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus菌株QLP12对番茄植株促生作用及番茄灰霉病的防治效果,采用平板对峙法测定菌株QLP12对番茄灰霉病菌即灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制作用,用离体叶片、果实、植株接种法研究其对番茄灰霉病的防效,并对盆栽番茄的促生效果、防御酶活性、丙二醛(MDA)和脯氨酸含进行测定。结果表明,菌株QLP12发酵滤液对灰葡萄孢菌丝生长的抑制率为58.97%,对分生孢子萌发的抑制率为89.28%;盆栽试验结果显示,菌株QLP12发酵液对番茄灰霉病的防效为50.20%;在灰葡萄孢胁迫下,菌株QLP12处理可诱导植株叶片组织防御酶活性和脯氨酸含量升高,丙二醛含量降低,同时促进番茄幼苗生长,株高、茎粗、干鲜比和叶绿素含量与对照相比均有显著提高。表明生防菌QLP12可通过诱导植株防御酶活性的提高,有效抑制番茄灰霉病发生,并促进番茄幼苗生长。     

青枯劳尔氏菌蛋白PopW表达条件优化及其诱导植物抗病功能

蛋白PopW是从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定得到的一种新的Harpin蛋白,为降低成本,我们对诱导剂IPTG的浓度进行了筛选,结果表明,诱导PopW蛋白表达的最适IPTG浓度为0.01 mmol/L。对蛋白PopW在诱导烟草抗TMV防卫反应中最适宜浓度和持效性的研究结果表明,用蛋白PopW处理的烟草在接种TMV后,其叶片上的枯斑数显著少于对照,且PopW浓度为2.5 mg/L时持效性可达8 d。同时,用蛋白PopW预处理的烟草接种TMV后,其叶片中PR-1a的表达量显著高于对照。浓度为2.5 mg/L的蛋白PopW可以分别诱导番茄对叶霉病、水稻对稻曲病的抗病性,防效达80.19%和86.84%。蛋白 PopW对辣椒还有一定的促生作用,田间经2.5 mg/L的PopW蛋白处理后可增产16.89%。     

1S,2R-((3-溴苯乙基) 氨基)-N-(4-氯-2-三氟甲基苯基) 环己烷基-1-磺酰胺对灰葡萄孢的抑菌活性及作用方式

研究了磺酰胺类化合物1S,2R-((3-溴苯乙基) 氨基)-N-(4-氯-2-三氟甲基苯基) 环己烷基-1-磺酰胺 (代号SYAUP-CN-26) 的抑菌活性及防治病害的作用方式。结果表明,SYAUP-CN-26可抑制多种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发,尤以对灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制活性较强,EC₅₀值分别为1.82 μg/mL和14.98 μg/mL。20 μg/mL的SYAUP-CN-26处理能显著降低灰葡萄孢的产孢量、产菌核量,增加单菌核重。经该化合物处理过的灰葡萄孢孢子及菌丝致病力均降低。200 μg/mL的SYAUP-CN-26对番茄灰霉病的保护效果和治疗效果分别为83.11%和47.52%,保护作用优于治疗作用。     

葡萄 VvSUC 27基因的克隆及病原响应表达分析

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病害之一, 严重影响葡萄产业的健康发展?其中, 致病力最强的为可可毛色二孢 Lasiodiplodia theobromae ?糖转运蛋白在调节植物对病原菌的免疫过程中起着至关重要的作用, 关于葡萄中糖转运蛋白参与植物免疫机制的研究尚未见报道?本试验从‘无核白’葡萄叶片中克隆得到蔗糖转运蛋白 VvSUC 27基因, 其开放阅读框全长1 515 bp, 预测蛋白质分子量为54 kD, 理论等电点(pI)为9.58?生物信息学预测该蛋白含有12个跨膜结构?实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:氨基环丙烷羧酸和脱落酸处理后 VvSUC 27的表达水平持续上调; 水杨酸和茉莉酸甲酯处理后, VvSUC 27的表达呈现上调表现但无规律的变化特征; 激发子chitin和flg22处理后, VvSUC 27基因信号响应快速且明显; 感病品种‘夏黑’接种可可毛色二孢后, VvSUC 27被迅速诱导, 3 h时表达量达到最高, 而后逐渐减弱?本研究将为今后阐明可可毛色二孢与葡萄互作的分子机制提供参考依据?     

灰霉菌(Botrytis cinerea)采后致病性研究

 灰霉菌(Botrytis cinerea)是引起葡萄采后病害的主要病原真菌之一。葡萄灰霉菌可在田间潜伏侵染,采后由健康果实携带进入销售市场,该菌的显著致病症状为果实软腐和脱落。灰霉菌与葡萄的其它采后致病菌,如链格孢菌(Alternaria alternata)、镰刀菌(Fusarium sp.)、芽枝霉(Cladosporium sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、黑曲霉(Aspergillus nigar)和粉红单端孢菌(Trichothecium roseum)相比,不仅表现出明显的潜伏侵染优势,而且具有较强的低温(4℃)条件下的致病优势。4℃低温下灰霉菌在寄主葡萄体外和体内分泌多聚半乳糖醛酸酶(PG)活力均显著高于以上各菌,而在25℃下无显著差异,这一结果与该2种温度下灰霉菌接种果实后的症状表现一致。     

枯草芽胞杆菌HMB19198菌株抑菌物质的鉴定及其对番茄灰霉病的防治

 设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和rpoC等看家基因序列比对将菌株HMB19198鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果表明,菌株HMB19198的脂肽提取物对灰霉菌表现较强的抑菌活性,通过色谱分离技术结合质谱分析,证明菌株HMB19198主要产生脂肽类抗生素丰原素(fengycin)和表面活性素surfactin,其中fengycin包含fengycin A(C15-C18)和fengycin C(C19-C20)两种同系物。抑菌活性测定表明,fengycin对灰霉菌表现较强的抑菌活性,显微观察发现,fengycin处理后造成灰霉菌菌丝畸形。通过对菌株HMB19198全基因组序列进行分析,获得fengycin合成酶基因簇,从基因水平证明菌株HMB19198可以产生fengycin。     

甲基营养型芽胞杆菌G-1抗菌肽的分离及抑菌作用研究

为探索甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus G-1抑制番茄灰霉病菌的作用机制，采用HPLC、LC-MS等对其分泌的抗菌肽进行分离鉴定，通过扫描电镜观测抗菌肽对番茄灰霉病菌菌丝形态影响，借助RNA-seq研究抗菌肽处理番茄灰霉病菌3、5 d后的差异表达基因。研究结果表明：甲基营养型芽胞杆菌G-1产生的抗菌肽主要为伊枯草菌素A。经菌株G-1抗菌肽处理后，番茄灰霉病菌菌丝生长异常，菌体畸形肿胀，内溶物外渗。基因差异表达分析表明，有40个基因在2个时期均差异表达。GO、KEGG富集分析发现，与萜烯合酶、氨基酸跨膜转运相关的15个基因在各时期均上调表达，与细胞表面受体信号通路、氧化还原酶、果胶裂解酶、单加氧酶等有关的25个基因在各时期均下调表达，其中编码琥珀脱氢酶（SDH）的Bcin02g06840基因及编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的Bcin04g04450基因表达量显著下调。经qRT-PCR验证，8个差异表达基因的表达模式变化与转录组测序分析结果一致。研究表明菌株G-1抗菌肽可能通过抑制番茄灰霉病菌细胞膜组分中SDH、HMGR的合成抑制菌丝及孢子的生长。     

棉疫病菌90kD胞外蛋白激发子生物活性与稳定性研究

 对棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)90 kD胞外蛋白激发子的生物活性与稳定性进行了研究。用不同浓度的激发子处理烟叶测定其诱发过敏反应的有效浓度,结果是所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可诱发过敏反应,但100 pmol/L不能诱发过敏反应,表明该激发子诱导烟草产生过敏反应的最低有效浓度在100 pmol/L~0.5 nmol/L之间。该激发子可诱导不同烟草(Nicotiana tabacum L.)品种产生过敏反应,但不能诱导辣椒(Capsicum annuum L.)和茄子(Solanum melongena L.)等茄科作物及棉花(Gossypium arboreum Linn.)发生过敏反应,初步表明该激发子诱导植物发生过敏反应具有一定的专化性。以10 nmol/L激发子溶液处理烟叶后分别于第0、24、48和72 h接种烟草疫霉(Phytophthora nicotianae),结果证明该激发子可以诱导烟草产生抗性反应,其抗性以处理后立即接种烟草疫霉为最强,接种后48h防效达68%,以后随时间的延长逐渐减弱。激发子分别经p H值2~14的水溶液25℃处理30 min,或分别经4、25、60和100℃处理5 min仍能诱发过敏反应,但是经蛋白酶K处理后不能诱发过敏反应。表明该激发子对酸、碱和温度不敏感,但对蛋白酶K敏感。     

烟草青枯病拮抗菌株X-60的分离鉴定及其表型组学分析

 为了探寻烟草青枯病的生防菌剂,本研究以烟草青枯病菌为指示菌,从烟草根围土壤中分离获得拮抗细菌X-60,其抑菌圈大小约为37 mm。经形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA序列分析,该细菌为解淀粉芽孢杆菌。抗菌谱测定表明,它对烟草灰霉病菌、烟草炭疽病菌、烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌均具有较强的拮抗作用,菌丝生长抑制率分别为51.28%、58.97%、60.53%和72.78%。温室盆栽试验表明,X-60菌液灌根对烟草青枯病发生具有良好的预防作用。表型芯片研究结果表明,解淀粉芽孢杆菌能代谢41%的碳源、77%的氮源、86%的磷源、69%的硫源,具有91种生物合成途径;72种碳源、45种氨基酸类氮源和190余种肽类氮源均能显著促进该菌的生长;其高效代谢的磷源有二硫代磷酸盐和半胱胺S-磷酸盐,高效代谢的硫源有硫代硫酸盐、S-甲基-L-半胱氨酸和硫辛酰胺。研究结果为解淀粉芽孢杆菌X-60生防菌剂的开发及将其应用于烟草青枯病的生物防治提供了理论基础。     

一种新的90 kD胞外蛋白激发子诱导烟草系统获得抗性研究

 就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)培养滤液中提纯获得的90 kD胞外蛋白激发子诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果是处理叶及其上、下各2片叶片上的枯斑数显著少于对照,诱抗防效达40.9%~53.1%;接种TMV7d后处理叶片的枯斑平均直径为1.23mm,显著小于对照叶片上的枯斑直径2.97mm,但是处理叶片的上、下叶片上的枯斑平均直径与对照没有显著差别。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片分别立即接种或于1、2、4、7、15 d接种TMV,结果证明该激发子诱导烟草对TMV的抗性以处理后第1d至第4 d接种为较好,防效达30.2%~5 0.4%;处理后立即接种和第7d接种TMV诱抗防效仅4%左右,处理叶片上的枯斑数与对照没有显著差别,表明较强的诱导抗性可持续时间<7d。用不同浓度激发子处理烟叶,所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可显著地诱发烟草对TMV产生获得抗性,诱导抗性效果为34.9%~5 8.2%,诱导抗性效果随浓度的降低呈下降趋势。以10 nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片,2 d后分别注射接种烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)菌液或喷雾接种烟草赤星病菌(Alternaria alternata)分生孢子,结果是,注射接种烟草野火病菌5d后处理叶片及其上、下叶片上的野火病病斑均显著小于对照;处理叶片上的赤星病病斑数及病斑面积明显小于对照,表明该激发子可诱导烟草对野火病和赤星病产生抗性。上述结果表明,90kD蛋白激发子诱导烟草产生的获得抗性是一种典型的系统获得抗性,该系统获得抗性对病原菌具广谱抗性。     

竹醋液对几种植物病原真菌的抑制活性

 新制竹醋液抑制6种作物8种病原真菌菌丝生长的活性大小序为:苹果霉心病菌 > 小麦赤霉病菌 > 黄瓜炭疽病菌 > 番茄灰霉病菌 > 葡萄炭疽病菌 > 番茄早疫病菌 > 草莓灰霉病菌 > 苹果腐烂病菌 > 苹果轮纹病菌 > 黄瓜灰霉病菌,有效抑制中浓度(EC₅₀)介于0.1185%-0.8035%(g/mL,干重/体积)之间。室温下保存1年的竹醋液抑制7种作物8种病菌菌丝生长的EC₅₀在0.0832%-0.3334%之间,对苹果霉心病菌的抑制活性下降,对6种作物的6种病菌的抑制活性均高于新制竹醋液。在2%水琼脂培养基上测定发现竹醋液明显抑制草莓灰霉菌分生孢子萌发,对该菌7个菌株的EC₅₀在0.0365%-0.1311%之间,平均为0.0673±0.0332%。叶盘漂浮法测定发现0.0125%、0.025%和0.05%的竹醋液对葡萄霜霉病的防效分别为23.5%、38.8%和78.4%,对葡萄霜霉病菌5个菌株EC₅₀在0.0191%-0.0464%之间,平均为0.0317 ±0.0109%。     

我国葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感性测定

灰霉病是葡萄生产上的重要病害之一,严重影响葡萄果实的品质和产量。为明确葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感性,本研究分别采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了四霉素和啶酰菌胺对采自云南省宾川县、湖北省武汉市和辽宁省北镇市60株葡萄灰霉病菌的有效抑制中浓度EC₅₀,建立了敏感性基线,并分析了二者之间的交互抗性。结果显示,葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感基线分别为0.245和1.115 μg/mL;上述葡萄灰霉病菌均对四霉素敏感,而11.7%的菌株表现为啶酰菌胺抗性。并且四霉素与啶酰菌胺之间不存在交互抗性(r=-0.040,P>0.05)。因此,四霉素可作为防治葡萄灰霉病的候选药剂,研究结果对两种杀菌剂的科学使用以及葡萄灰霉病的可持续防控具有重要的理论和实践意义。     

中药丁香提取物对番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果

 试验测定了中药丁香的甲醇提取物对番茄灰霉病菌室内抑菌作用和对番茄灰霉病的温室防治作用。室内抑菌试验采用菌丝干重法测试结果表明,提取物在20 000μg/mL和10 000 μg/mL两个浓度下对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用均达到了80%以上,5 000μg/mL浓度下抑制作用迅速下降到35.37%。在抑制分生孢子产生的测试中,浓度为10 000μg/mL的处理完全抑制了分生孢子的产生,浓度为5 000μg/mL的处理也表现出显著的抑制产孢作用,抑制率达到85.40%,而进一步稀释的处理则没有表现出显著抑制作用。采用生长速率法测试了丁香提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制中浓度,结果表明其抑制中浓度为3 292.38μg/mL。在温室盆栽试验中,浓度为20 000μg/mL的处理对番茄灰霉病的保护防治效果达到86.45%,与化学药剂处理达到无显著差异,浓度为10 000μg/mL的处理在保护作用测试中也表现出了显著的防治效果。