沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能，根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据，应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列，分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系，采用实时荧光定量技术（real-time quantitative polymerasechain reaction，qPCR）测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明，沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp，开放阅读框长为1 479 bp，编码492个氨基酸；沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高，为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达，成虫滞育期间相对表达量维持在低水平，而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0~40℃范围内，随着温度增加，己糖激酶基因在沙葱萤叶甲成虫体内相对表达量呈先升高后下降的趋势。采用RNA干扰技术沉默沙葱萤叶甲成虫己糖激酶基因2 d后，与对照相比，己糖激酶基因相对表达量下调90%以上，4 d后仍下调40%以上；该基因干扰后12 d内，沙葱萤叶甲成虫存活率下降了25%以上。表明己糖激酶基因可能在沙葱萤叶甲生长发育和滞育过程中起着重要作用。     

褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domain serine protease,CSP）是广泛存在于昆虫体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类,在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定获得一个褐飞虱CSP编码基因NlCSP4（GenBank登录号：OK018340）,其cDNA序列全长1911 bp,编码636个氨基酸,预测蛋白质分子量为69.29 kD,等电点为9.02。NlCSP4蛋白N端包含一段由25个氨基酸残基组成的信号肽和一段由44个氨基酸残基组成的clip结构域,C端具有CSP蛋白家族典型的Tryp_SPc结构域,且其中包含特异性保守的His-Asp-Ser催化中心三元件。系统发育分析表明NlCSP4与其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ进化树上聚为一支,而与鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,NlCSP4基因表达具有明显的时空特异性,其在雌成虫中的表达量最高,且高龄若虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄若虫期;NlCSP4基因在褐飞虱雌成虫脂肪体、肠道和卵巢中均有表达,且在脂肪体中表达量最高;金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）和金龟子绿僵菌（丝状病原真菌）诱导72 h内NlCSP4表达量均显著上调,但大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）短时间（36 h内）诱导效果不明显。显微注射NlCSP4基因dsRNA可显著抑制褐飞虱5龄若虫NlCSP4的表达水平。生物测定试验表明,NlCSP4干扰后褐飞虱5龄若虫存活率显著下降,且对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。本研究结果初步证实了褐飞虱NlCSP4在宿主生长发育和免疫防御过程中发挥重要调控作用,可作为开发RNAi介导的褐飞虱防控技术中的一个重要潜在靶标。     

黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及表达模式分析

为明确黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白(Nephotettix cincticeps peptidoglycan recognition protein,Nc PGRP)的功能,利用RT-PCR克隆长度为552 bp的Nc PGRP开放阅读框,其编码蛋白大小为19.9 k D,无信号肽,含3个锌离子结合/酰胺酶催化位点,1个二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚糖识别位点。系统发育分析表明,Nc PGRP与其他昆虫亲缘关系较远。利用显微注射技术对黑尾叶蝉进行病原细菌诱导,定量PCR结果显示Nc PGRP在受大肠杆菌及藤黄微球菌刺激后,其转录水平显著上调。组织分布研究表明,Nc PGRP的m RNA在各组织中均有表达,且头部表达量最高。黑尾叶蝉取食感染水稻普通矮缩病毒RDV的水稻后,Nc PGRP转录水平受抑制。本文研究表明,Nc PGRP是一种诱导型表达的PGRP,黑尾叶蝉感染RDV能显著抑制其转录,进而削弱黑尾叶蝉免疫能力,这可能有利于RDV与黑尾叶蝉共生。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp10a的克隆、分子特征与表达分析

为明确热激蛋白HSP10在沙葱萤叶甲Galeruca daurica生长发育过程中的作用,采用RTPCR及RACE技术克隆沙葱萤叶甲Hsp10基因cDNA的全长序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,并利用qPCR技术对该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段、成虫羽化后不同时期以及不同温度下的表达谱进行分析。结果表明,克隆获得1条新的沙葱萤叶甲Hsp10基因,命名为GdHsp10a,GenBank登录号为MG460308,cDNA序列全长为526 bp,开放阅读框为333 bp,编码蛋白含110个氨基酸,预测分子量为11.97 kD,等电点为9.74;无信号肽及跨膜结构。同源比对及系统进化分析表明,GdHSP10a与光肩星天牛Anoplophora glabripennis HSP10亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为53.15%。qPCR结果表明,GdHsp10a在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫期的表达量显著高于幼虫期、预蛹期及蛹期;成虫羽化后不同时期表达量差异显著,25 d时表达量最高,其次为100、10和7 d时的表达量;温度对GdHsp10a表达量有显著影响,30℃下表达量最高,35℃下表达量次之,15、20、25及40℃下表达量最低且无显著差异。表明GdHsp10a可能在沙葱萤叶甲生长发育及成虫越夏中起着多重作用。     

黏虫MagR和Cry2基因的时空表达分析

为了明确黏虫MagR、Cry2基因在定向行为中的作用,本研究采用基因序列分析及实时荧光定量技术,研究了黏虫MagR、Cry2基因的基因序列特征及其表达模式。结果表明,黏虫MagR基因编码131个氨基酸,蛋白分子量为14.17 kD,等电点为9.3,具有多个铁硫簇结合位点;黏虫Cry2基因编码757个氨基酸,蛋白分子量为87.04 kD,等电点为8.73。羽化后不同日龄迁飞型黏虫成虫各部位Cry2基因表达量存在显著差异。羽化后3 d成虫头部和胸部Cry2基因表达量显著高于其他日龄。迁飞型黏虫成虫羽化后不同日龄各部位MagR的表达量具有显著性差异;5 d时各部位的表达量达到最高,各日龄头部和胸部的表达量均显著高于腹部。     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据。本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3（GenBank登录号：MT682352）,cDNA序列全长1226 bp,读码框全长432 bp,编码143个氨基酸残基。氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为C₁—X₂₆—C₂—X₃—C₃—X₃₇—C₄—X₁₀—C₅—X₈—C₆,完全符合典型气味结合蛋白所具有的六个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有5个亲脂性区域,其中第62～75位的氨基酸残基形成明显的亲脂性口袋。预测该蛋白分子量为15.50 kD,等电点为5.24,N—末端包含21个氨基酸组成的信号肽序列。FoccOBP3与横缝茧蜂Diachasma alloeum的DallGOBP（GenBank登录号为XP_015125081.1）、赤拟谷盗Tribolium castaneum 的TcasPBP（GenBank登录号为XP_015835846.1）和TcasOBP07（GenBank登录号为EFA04593.1）的氨基酸序列一致性较高。FoccOBP3与埋葬甲虫Nicrophorus vespilloides的NvesGOBP（GenBank登录号为XP_017781594.1）聚在最小的一个分支,表明与该基因亲缘关系最近。FoccOBP3蛋白含有组成α—螺旋的氨基酸残基127个,形成β—折叠的氨基酸残基58个,形成β—转角的氨基酸残基15个。FoccOBP3蛋白骨架是由 6 个α—螺旋和连接这些螺旋的回折构成,其中5个α—螺旋形成一个结合口袋。FoccOBP3在西花蓟马1龄若虫中高表达,其次是羽化5 d的雌虫,其余发育阶段的表达量均较低;且在雌、雄性成虫中的表达量亦有差异,除了羽化10 d的,羽化1、5、15 d雌虫的表达量均比同发育阶段雄虫的高。该基因在西花蓟马成虫触角中高表达,其次是头部,在腹、足中的表达较低,在胸部微表达。本研究克隆获得西花蓟马气味结合蛋白基因FoccOBP3,明确了其核苷酸、氨基酸序列特征,预测了该蛋白的二级、三维结构,测定了FoccOBP3在西花蓟马中的时空表达,推测该基因可能在西花蓟马气味识别、寄主定位等方面发挥重要作用。     

茶尺蠖脂肪酶合成基因EoL2的克隆和组织表达特征

昆虫脂肪酶可参与脂类消化、吸收和运输,并能介导植物的抗病虫功能。本研究通过茶尺蠖唾液腺转录组数据库发掘到该基因片段,采用RACE技术克隆获得了一条茶尺蠖脂肪酶合成基因序列,命名为Eo L2,并检测了其在茶尺蠖不同生育期及不同组织部位中的相对表达水平。研究结果表明,Eo L2的c DNA序列全长1310 bp,开放阅读框为1041 bp,编码一个包含346个氨基酸的蛋白,推测该蛋白相对分子量为37.96 k D,推测等电点(PI)为8.41,具有脂肪酶典型的GXSXG丝氨酸活性保守序列,其氨基酸序列与家蚕相似度最高,为57%。实时荧光定量PCR结果表明,Eo L2在卵中的表达量显著低于其它虫态;在1龄幼虫期的相对表达水平显著高于2~5龄;在成虫中的表达量显著高于蛹;在血淋巴中的表达量显著高于中肠、表皮、脂肪体和唾液腺。     

粘虫脂动激素基因MsepAKH1的克隆与成虫期表达模式分析

为明确脂动激素基因AKH在粘虫Mythimna separata(Walker)能源代谢过程中的作用,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术测定该基因在成虫期的组织与发育阶段表达模式。结果表明,粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA序列全长为449 bp,GenBank登录号为KP979739.1,开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸,具有昆虫脂动激素基因家族典型的结构特征;预测该基因编码的MsepAKH1蛋白分子量为7.61 kD,等电点为8.46,MsepAKH1的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta、二化螟Chilo suppressalis、小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、家蚕Bombyx mori的AKH氨基酸序列同源性较高。MsepAKH1基因在粘虫初羽化雌蛾不同组织间的表达量差异显著,主要在头部和飞行肌内表达,分别约为同日龄雌蛾脂肪体内表达量的15.4倍与8.1倍,在脂肪体、卵巢与中肠内的表达量显著降低。对不同日龄雌蛾头部和飞行肌内的表达量检测发现,在7日龄雌蛾头部和3日龄雌蛾飞行肌内的表达量分别显著高于其它日龄雌蛾相同组织中的表达量,分别约为初羽化雌蛾相同组织表达量的2.4倍与1.6倍。表明MsepAKH1基因的表达因粘虫雌蛾组织与日龄间的不同而呈现动态变化。     

大草蛉雄虫卵黄原蛋白基因的鉴定和表达特征

为探索卵黄原蛋白基因对大草蛉雄虫生殖生理等活动的调节作用,利用PCR技术克隆了大草蛉卵黄原蛋白基因部分cDNA序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在不同发育阶段和不同组织的表达特征。结果表明,克隆到的卵黄原蛋白基因的cDNA长度为1501 bp,编码501个氨基酸,其预测的蛋白质分子量为206 kD,等电点8.11,具有vitellogenin保守的半胱氨基酸残基、GL/ICG、RXXR等结构域。序列分析表明大草蛉vitellogenin与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不太高,在29.46%～36.43%,与骚扰锥蝽在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果显示vitellogenin在不同日龄的成虫中表达量没有显著差异;在雄虫的腹部表达量较高,均高于头部和胸部,且头部和胸部的表达量之间没有显著差异,表达量均较低。结果表明vitellogenin基因在大草蛉中的表达具有组织的特异性,推测其可能参与大草蛉雄虫生殖调控。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

菜粉蝶Pain离子通道基因的克隆和功能研究

通过克隆十字花科蔬菜重要害虫菜青虫Pieris rapae瞬时感受器电位通道中的Painless（Pain）基因，实现它的体外功能性表达，为进一步研究其在鳞翅目昆虫中的生理功能提供重要依据。根据菜青虫的转录组数据，采用RT-PCR克隆菜青虫Pain基因得到完整开放阅读框；利用哺乳动物表达系统在体外表达菜青虫Pain离子通道。鉴定出菜青虫Pain基因是GenBank登录号为NW_019093434.1的序列。其完成开放阅读框由2850个核苷酸组成，编码949个氨基酸。预测蛋白分子量为108.3 kDa，理论等电点pI为5.37。预测该基因所编码蛋白序列有2个结构域，分别是包含8个锚蛋白重复序列的锚蛋白结构域和6个跨膜区的跨膜结构域。氨基酸序列比对结果显示菜青虫Pain和家蚕、帝王蝶、小菜蛾以及烟草天蛾Pain的序列相似度都高达70%以上，但与黑腹果蝇Pain的序列相似度仅有31%。进化分析结果显示菜青虫Pain离子通道和小菜蛾以及帝王蝶的Pain离子通道的亲缘关系最近。体外钙流检测结果表明，菜青虫Pain离子通道可被43℃缓冲液激活，这说明菜青虫Pain离子通道可以感受高温。     

黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因(allatostatin,AST)在调控黏虫Mythimna separata(Walker)保幼激素(juvenile hormone,JH)中的功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902bp,开放阅读框378bp,编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33kD,等电点为9.25,具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明,黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高,头部其次,卵巢最低;黏虫头部AST表达量在7日龄最高,飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用,明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。     

不同杀虫剂对水稻黑尾叶蝉防控效果初探

为明确不同药剂对黑尾叶蝉的防治效果,2013年进行了田间药效比较试验。结果表明:烯啶·噻嗪酮70%可溶性粒剂、呋虫胺25%可湿性粉剂、烯啶虫胺60%可湿性粉剂、噻虫嗪25%可溶性粒剂和吡虫啉25%可湿性粉剂等药剂对黑尾叶蝉均具有理想的防治效果,可作为稻田不同时期黑尾叶蝉的防治药剂。其中烯啶·噻嗪酮70%可溶性粒剂对黑尾叶蝉成虫和若虫均具有较好的速效性和持效性,可迅速有效地控制田间虫量,药后1~10d的防效为68.53%~100%。     

细胞黏附蛋白NlPER1影响褐飞虱的存活与繁殖

为明确褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)细胞黏附蛋白(peroxinectin 1,NlPER1)在调控褐飞虱生长、发育及繁殖中的作用及其机理,通过克隆NlPER1基因的cDNA全长,分析NlPER1在褐飞虱不同组织和龄期中的表达谱,同时利用RNA干扰技术探究其生物学功能。结果显示,NlPER1包含1个1 560 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码519个氨基酸;预测该基因编码的蛋白分子量为58.9 kD,等电点为5.61,无分泌信号肽和跨膜区,具有亚铁血红素结合位点和Ca~(2+)结合位点。该基因在褐飞虱头部组织中的相对表达量最高,并显著高于其它组织;在5龄若虫和初羽化成虫中的相对表达量显著高于其它龄期;其转录水平不受球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染的影响。沉默NlPER1不影响褐飞虱若虫体内的H_2O_2含量,但会导致褐飞虱若虫存活率、雌成虫蜜露分泌量及产卵量显著下降,分别只有dsGFP对照组的52.94%、69.86%和69.00%。表明NlPER1在褐飞虱生长发育、存活与繁殖中发挥着重要作用,但这些作用与清除褐飞虱体内的H_2O_2无关。     

棉铃虫 JNKs 基因的克隆及表达分析

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族(mitogen-activated protein kinases, 丝裂原活化蛋白激酶)的重要成员, 具有参与昆虫抗逆反应等多种功能。为明确JNK在棉铃虫 Helicoverpa armigera 中的表达特性及其对Bt杀虫蛋白的应激与免疫反应, 本研究通过PCR克隆得到2个棉铃虫 JNK 基因 HaJNK1 和 HaJNK2; 生物信息学分析结果显示: HaJNK1和 HaJNK2基因开放阅读框分别为1 191、1 143 bp, 分别编码397、381个氨基酸。系统进化树分析结果表明棉铃虫 HaJNK1 与黏虫 Mythimna separata 聚为一支, 亲缘关系较近, HaJNK2与 家蚕 Bombyx mori 聚为一支, 同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术分析 HaJNK1 与 HaJNK2 在棉铃虫不同发育时期、不同组织中的表达量, 发现 HaJNK1 与 HaJNK2 在卵中表达量最高, 其次是雌成虫; HaJNK1 在性腺中表达量最高, 其次是唾液腺; HaJNK2 在头部表达量最高, 其次是性腺。取食Cry1Ac的4龄棉铃虫幼虫的中肠组织中, HaJNK1 与 HaJNK2 的表达量均显著升高。推测 HaJNKs 基因可能参与棉铃虫抵御Bt杀虫蛋白伤害的应激和抗逆反应。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶，在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列，该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp，开放阅读框长度为2061 bp，编码686个氨基酸组成的多肽，分子量约76.1 ku，等电点5.68，具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明，MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近，其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高，达92%。基因表达水平研究发现，MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达，在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后，MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异，经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。