我国梨和部分国外梨果实上链格孢菌的鉴定研究

本文从链格孢的产孢表型、分生孢子特征和分子生物学方面研究了从河北鸭梨、新疆库尔勒香梨、美国和日本以及智利的梨上分离的链格孢菌的种类.经对115支Alternaria菌株的形态学鉴定,共确定了3个种,即Alternaria alternata、A.tenuissima和A.infectoria.ITS系统发育分析研究表明,Alternaria大孢子种彼此间及大孢子种与小孢子种间已发生明显分化,可以根据ITS序列差异明确区分.而供试的多数小孢子种在ITS序列上差异很小,因而不能根据ITS序列差异来区分.     

山东省危害核桃的链格孢属真菌鉴定及其系统发育

为了明确危害核桃的链格孢属Alternaria真菌种类,对34个供试菌株在PCA培养基上的培养特征、产孢表型、分生孢子特征等进行了研究,并采用ITS、OPA2-1和OPA1-3序列分析其系统发育。其中33个菌株为链格孢A.alternata,1个为细极链格孢A.tenuissima。链格孢:菌落灰色;孢子链短、分枝频繁,每条分枝含4～10个孢子;分生孢子多倒梨形,孢身平均25.6μm×7.4μm,横隔膜2～8个。细极链格孢:菌落褐色;孢子链长、少分枝,孢子链约含10个孢子;分生孢子多长椭圆形,孢身平均26.3μm×13.5μm,具柱状喙及假喙,主横隔膜1～6个,孢身中部的隔膜较粗。链格孢属真菌在遗传上有较大差异,ITS、OPA2-1和OPA1-3序列对链格孢小孢子种具有一定的区分作用,链格孢是危害核桃的主要链格孢属种。     

引起葡萄叶斑病的链格孢种类的初步鉴定

为明确北京市大兴区、顺义区和山西省襄汾县葡萄树上叶斑病的病原菌,利用组织分离法对病样进行分离纯化,采用多基因系统发育学分析(ITS,Alt a 1和gpd)和形态学对纯化后菌株进行鉴定,并结合柯赫氏法则对其进行验证。结果表明,共获得37株链格孢属真菌菌株,分属链格孢Alternaria alternata、葡萄链格孢A. viniferae和乔木链格孢A. arborescens,柯赫氏法则检测结果显示接种菌株对所接叶片与果穗均具致病性,说明这3种链格孢种均为葡萄叶斑病的病原菌;葡萄链格孢为主要的病原菌,有28株,故将该类病害命名为葡萄链格孢叶斑病;此外,该类菌株在2～40℃之间均能生长,25℃为最适生长温度。     

马铃薯早疫病病原菌鉴定及其对不同药剂的敏感性

 为了明确马铃薯早疫病病原菌及其对不同药剂的敏感性,2009~2011年从河北省5个县采集180个早疫病样,以常规方法进行分离与纯化。根据病原菌的形态特征和致病性,结合其rDNA-ITS区域的序列分析对病原菌进行鉴定,并采用菌丝生长速率法测定病原菌对不同药剂的敏感性。结果分离到两种菌（A、B）,分离比例为4:6。致病性测定证实分离菌A和B均为马铃薯早疫病病原菌。经形态学鉴定,初步认定A为茄链格孢（Alternaria solani）,B为链格孢（Alternaria alternata）。采用通用引物ITS1/ITS4对病原菌A和B的rDNA-ITS序列区扩增并测序,通过与GenBank数据库比对,A与A.solani同源性为98%,B与A.alternata 的同源性达100%。两种病原菌对咯菌腈、吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、苯醚甲环唑等药剂的敏感性差异极显著,而对异菌脲的敏感性差异不显著。因此,将河北省马铃薯早疫病菌鉴定为茄链格孢（A.solani)和链格孢（A.alternata）,二者对同一药剂的敏感性不同。     

黄骅冬枣细极链格孢的分离鉴定

从黄骅冬枣发病叶片上分离到一株真菌L5-4-2,对其进行了菌落形态、分生孢子形态特征观察和致病性测试。ITS序列分析结果表明,该分离物L5-4-2与链格孢属(Alternaria sp.)(JN689942.1、JN545807.1、JF694748.1、MN115554.1)序列的相似性均在99.25%以上;ACT序列分析表明,分离物L5-4-2与细极链格孢(Alternaria tenuissima)在同一个分支,且Bootstrap支持率为100%。结合菌落形态特征、分生孢子形态特征及致病性测试结果 ,将其鉴定为细极链格孢[Alternaria tenuissima (Fr.) Wiltshire]。     

河南省小麦黑胚病菌的分离鉴定及致病性测定

 为明确我国小麦主产区河南省小麦黑胚病菌的主要类群,为该病的防治工作提供理论依据,对河南省不同地区种植的50个小麦品种(系)的黑胚籽粒进行了分离鉴定和致病型测定。鉴定结果表明：河南省小麦黑胚籽粒病原分离物包括链格孢(Alternaria alternate)、麦根腐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、细极链格孢(A. tenuissima)和小麦链格孢（A. triticina）,平均分离频率分别为63.0%、18.0%、12.2%和6.8%,不同品种小麦黑胚籽粒各种病原菌分离频率有一定差异。扬花后10 d利用孢子悬浮液接种进行分离物的致病性测定,结果表明链格孢(A.alternate)和麦根腐蠕孢（B. sorokiniana）致病力较强。结合分离频率和致病性测定结果,确定链格孢(A. alternate)是河南省小麦黑胚病的优势病原菌。     

美国大豆中链格孢的分离鉴定研究

本文通过对美国进境大豆病害分离,共得到36个菌株,并对其中5株链格孢菌进行了形态学和分子生物学鉴定(其中2株),确认了它们分别是细极链格孢(Alternaria tenuissima(Kunze)Wiltshire)、樱桃链格孢(Alternaria cerasiPotebnia)、苘麻链格孢(Alternaria abutilonis(Speg.)Schwarze)、百日菊链格孢(Al-ternaria zinniaeH.Pape)、落葵链格孢(Alternaria basellaeT.Y.Zhang)。本研究证实了美国大豆中链格孢菌的多样性,不仅充实了正在构建的大豆病害数据库和菌种资源库,也可为港口的植物检疫工作提供借鉴。     

北京市生菜链格孢根腐病病原菌鉴定

为明确北京市生菜链格孢根腐病的病原菌种类,采用常规组织分离法分离获得病原菌,依据柯赫氏法则对病原菌进行致病力检测,并利用分子生物学技术结合形态学鉴定确定病原菌分类地位。结果显示,从生菜病样组织中分离到2种病原菌共18株,形态学鉴定结果为芸薹链格孢Alternaria brassicae和万寿菊链格孢A. tagetica,分离比例分别为55.6%和44.4%,且二者均能单独侵染生菜根部,前者致病力较后者强,亦能复合侵染。对致病菌株进行GAPDH基因的PCR扩增和测序,并建立了基于GAPDH基因序列的系统发育树,聚类分析结果与形态学鉴定结果一致,因此证实北京市生菜链格孢根腐病是由芸薹链格孢和万寿菊链格孢复合侵染所致。     

北京地区桃黑斑病新症状的发现与诊断

2019年-2020年在北京地区桃园病害调研普查时发现一种桃树病害的新发症状-新叶坏死,主要症状表现为当年新生枝条顶端新叶和生长点腐烂坏死。为明确这种新叶坏死症状是否由病原菌侵染引起,从北京平谷2个乡镇3个桃园采集35份病梢样品,经病样组织分离和菌株纯化,选取12个代表性菌株进行形态学鉴定、系统进化分析以及致病性测定。结果显示,通过形态学鉴定和多基因(ITS,Alt a1,gpd)系统发育分析,以上分离株均鉴定为链格孢Alternaria alternata;3株代表性菌株的致病性测定验证了A.alternata是引起新叶坏死症状的病原菌,并且该病原菌也能导致桃枝条和果实发病,产生黑斑病症状。这是首次报道A.alternata除了引起桃果实黑斑症状之外,还可以引起桃树新叶坏死症状,结果进一步丰富了链格孢侵染桃树的症状多样性,为链格孢引起的病害的整体防控提供了理论基础。     

南疆骏枣黑斑病症状表现及病原菌鉴定

为明确南疆骏枣黑斑病的症状表现及病原菌种类,2013—2014年在新疆建设兵团第一师选取具有代表性的5个骏枣园,对枣叶、花、果等组织上黑斑病的症状进行了系统调查,采用组织分离法和回接试验分离病原菌及测定其致病性,并根据病菌形态特征、ITS序列和β-tubulin序列分析对病原菌进行了鉴定。结果表明:枣叶、花和果均可感染黑斑病菌,室内接种和田间骏枣黑斑病症状相同,叶、花和果中的病原菌可以相互侵染,并在枣果上均表现出黑斑病典型症状;不同发病组织中分离纯化得到357株菌株,形态观察表明,侵染叶、花和果的菌株均为链格孢属链格孢菌Alternaria alternata(Fr.)Keissler;通过ITS序列和β-tubulin序列分析,并结合形态学特征进一步确定引起骏枣不同组织的黑斑病病原菌为链格孢菌A.alternata。     

Using real-time PCR to survey frequency of azoxystrobin-resistant allele G143A in Alternaria populations from almond and pistachio orchards in California

Alternaria spp. cause leaf spot of almond and Alternaria late blight of pistachio in California, and azoxystrobin is a strobilurin fungicide that has been registered for the control of these diseases. To date, only a single point mutation of G143A in cytochrome b resulting to azoxystrobin resistance in Alternaria spp. was found in California. Based on this single point mutation, a real-time PCR assay was developed to quantify the frequency of the resistant allele G143A (FA) in pathogen samples taken from orchards. Forty-one almond and pistachio orchards were arbitrarily selected in eight counties of California. Fifty leaf lesions caused by Alternaria spp. per orchard were cut to extract the fungal DNA for a real-time PCR assay to determine the FA. About 88% of 41 surveyed orchards had Alternaria spp. with FA > 0.90, while six pistachio orchards showed a FA < 0.90. Therefore, azoxystrobin-resistant Alternaria populations are predominant in almond and pistachio orchards in California, and sprays of azoxystrobin to control Alternaria diseases are not recommended in these orchards. This study shows a potential use of a real-time PCR assay to efficiently quantify the frequency of azoxystrobin-resistant Alternaria spp. from large number of samples.     

苹果树皮内生真菌的分离及其对腐烂病的生物防治潜力

为了明确苹果树皮中内生真菌的种类及其对苹果树腐烂病菌的抑制作用,对25年生富士苹果健康树皮中的内生真菌进行了分离和初步鉴定,并通过室内抑菌试验和田间保护作用试验测定其内生真菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用。分离到的126株内生真菌分属于13个属,主枝中分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验中对苹果树腐烂病菌的抑菌率在40%以上的有24株,其中87.5%的菌株为链格孢属真菌。Al 6的培养滤液对腐烂病菌菌丝生长抑制作用较强,抑制率为83.76%;Al 58对其孢子萌发抑制作用较大,抑制率为82.42%;Al 67产生的挥发物质对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用较大,为24.41%。田间试验结果显示,用拮抗性内生真菌预先占位接种苹果树枝干,能有效抑制腐烂病菌的侵入和病斑的扩展,Al 107的抑制作用最强。     

油菜菌核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析

采用平板拮抗筛选,分别从西藏日喀则地区和拉萨地区杂草根围土壤中筛选到2个对油菜菌核病菌有显著拮抗活性的芽孢杆菌菌株RJGP16和YBWC43。通过生理生化鉴定、16S rDNA序列分析和BOX-PCR指纹图谱分析,鉴定菌株RJGP16为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus, 菌株YBWC43为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。离体叶片试验结果显示,菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病菌防治效果分别为50.24%和100.00%。脂肽化合物种类分析显示,菌株RJGP16产生脂肽化合物表面活性素和芬枯草菌素,菌株YBWC43产生杆菌霉素D和芬枯草菌素。表明菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病的防治效果与其产生的脂肽化合物有关。     

冬青卫矛内生放线菌YDG17菌株发酵液抑菌活性研究

从冬青卫矛植株中筛选得到一株内生链霉菌YDG17,其发酵液对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。室内生物测定结果表明,YDG17菌株发酵液对供试的11种植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,其中对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Fulvia fulvum和番茄早疫病菌Alternaria solani的抑制作用最强,EC50值分别为259.98、336.13和100.72 mg/L;对供试的3种植物病原真菌孢子萌发也均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用最强,EC50值为87.84 mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。捷克八溶剂系统纸色谱测定结果表明,该发酵液的主要活性物质为碱性水溶性抗生素。选用弱酸性离子交换树脂吸附法对YDG17发酵液活性成分进行了初步分离,并对其活性馏分进行ESI-MS/MS分析,表明其活性物质主要为链丝菌素类化合物,该类化合物为首次从植物内生菌中分离得到。     

山东省小麦赤霉病菌种群组成及其致病力分化

由禾谷镰孢菌群Fusarium graminearum clade引起的赤霉病是小麦的重要病害。为明确山东省小麦赤霉病菌的种群组成及其致病力,于2011年和2012年从山东省15地市分离了95株小麦赤霉病菌,在形态和分子生物学鉴定种的基础上,采用鉴定B型毒素化学型的特异性引物进行毒素化学型分析。在95个菌株中,93株分离物为禾谷镰孢菌F.graminearum,2株为燕麦镰孢菌F.avenaceum。94株分离物为脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)化学型,1株为雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol,NIV)化学型。在94株DON毒素化学型菌株中,90株为15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-AcDON)化学型,4株为3-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-AcDON)化学型。在小麦扬花期,采用单花滴注接种法对29个菌株进行了致病力测定,供试菌株的致病力分化明显。表明在山东省冬小麦产区,产15-AcDON毒素的F.gra-minearum是小麦赤霉病菌的优势种群。     

白僵菌对盲蝽的致病性

我国棉花盲蝽的发生危害日益严重,而化学防治是当前控制这类害虫的唯一有效途径.为了探索盲蝽的微生物防治技术,在室内条件下利用浸虫法评价了7个白僵菌菌株对我国3个盲蝽优势种类--绿盲蝽、中黑盲蝽和苜蓿盲蝽的致病能力.结果显示,不同菌株对不同种类盲蝽的致病效果存在较大差异,菌株C-1对绿盲蝽的致病力优于对中黑盲蝽和苜蓿盲蝽,菌株07-2-3、07-10-10、07-10-11、07-10-12和07-10-14对中黑盲蝽和苜蓿盲蝽的致病力优于对绿盲蝽.在7个菌株中,C-1对绿盲蝽2龄若虫的致病力最强,其LC50为5.34×106个孢子/mL.菌株C-1的致病力随着绿盲蝽若虫龄期的增加而减弱.在浓度为1×107个孢子/mL时,菌株C-1对绿盲蝽2～4龄若虫的致死中时间分别为7.11、8.37和12.44天;在浓度为1×108个孢子/mL时,分别为3.14、3.87和4.95天.研究表明,白僵菌在防治我国棉花盲蝽方面具有较大的应用潜力.     

Variability of Cuban and International Populations of Alternaria solani from Different Hosts and Localities: AFLP Genetic Analysis

As causal agent of early blight disease in tomato and potato, Alternaria solani is an internationally important horticultural pathogen. Genetic variability was surveyed by amplified fragment length polymorphism analysis in a total of 112 isolates from potato and tomato, representing pathogen populations from different Cuban provinces together with isolates from the USA, Brazil, Turkey, Greece and China. Also included in the analysis were isolates from catenulated Alternaria spp. from Brazil, Canada, Greece and Russia, along with single isolates of Alternaria porri, Alternaria alternata and a Curvularia sp. UPGMA clustering revealed a differentiation between the isolates of A. solani and all other species with the exception of A. porri which could not be distinguished from A. solani. Among the isolates of A. solani, two distinct subclusters were formed, with high genetic significance revealed by bootstrapping, corresponding to a general subdivision based on the respective solanaceous host. The results are discussed with regard to potential host specificity of A. solani on tomato and potato, and in terms of the comparative contributions of regional and international genetic variability in populations of this ubiquitous plant pathogen.     

哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达

采用室内筛选与田间防效相结合的方法,对哈茨木霉抑制黄瓜尖孢镰刀菌的拮抗机制进行了研究。对峙培养结果显示,木霉菌和病原菌间均形成了较明显的抑菌圈,对病原菌的抑菌率达66.7%~85.8%,其中菌株TG、TM对枯萎病菌抑制作用较强。木霉菌可有效提高根系对病原菌的抗性,黄瓜植株接种枯萎病菌后,根系细胞大量死亡,而先接种木霉菌再接种病原菌后则减小了对根系的伤害。田间防效试验结果表明,TG和TM孢子悬浮液浓度在108个/mL时防效最好,分别为54.9%和49.4%。接种木霉菌植株根系抗性基因的表达量均高于对照植株,呈双峰趋势。在第6天时抗性基因表达量最高,WRKY6、MYB、PR-1、PAL、GST和GLU的表达量分别为对照的5.15、5.22、6.07、6.00、3.16、和16.15倍。表明木霉菌通过激活与胁迫相关的基因表达提高了对病原菌的抗性。     

云南葡萄产区葡萄炭疽病病原鉴定及致病力分析

为了明确引起云南葡萄产区炭疽病的病原种类,利用形态鉴定和特异性引物分子检测相结合的方法对从云南省主要葡萄产区采集的60株炭疽病菌菌株进行了鉴定。葡萄炭疽病菌菌株的菌落形态和生长速率与对照菌株尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum差异不明显,但其分生孢子大小显著小于尖孢炭疽菌,附着胞深褐色,球形或不规则形。胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides特异性引物CgInt/ITS4从供试葡萄炭疽病菌菌株基因组DNA中扩增出1条约500 bp的特异性条带,而尖孢炭疽菌特异性引物CaInt2/ITS4对葡萄炭疽病菌无扩增条带。研究表明,引起云南葡萄主产区炭疽病的病原为胶孢炭疽菌;供试胶孢炭疽菌对红提葡萄均有致病力,但菌株致病力差异较大,对番茄和草莓存在交叉侵染的能力,且对多菌灵的敏感性较尖孢炭疽菌高。     

Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California

Failure to control Alternaria late blight in a few California pistachio orchards was observed after only 3-4 years of consecutive applications of azoxystrobin-based fungicide programs. A total of 72 isolates of Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, and Alternaria arborescens, the causal organisms of Alternaria late blight, were collected from pistachio orchards with (58 isolates) and without (14 isolates) a prior history of azoxystrobin applications. The sensitivity to azoxystrobin was determined in conidial germination assays. Isolates from orchards with a history of azoxystrobin applications had EC₅₀ values greater than 100 μg/ml, whereas isolates from orchards without a prior history of azoxystrobin usage had EC₅₀ values ranging from 0.008 to 0.045 μg/ml. Azoxystrobin resistance correlated with a single mutation in the cytochrome b (cyt b) gene causing a change of glycine to alanine at amino acid position 143. A pair of PCR primers AF and AR was developed that amplified a 226-bp DNA fragment of the cyt b gene containing the mutation site from all three Alternaria species but not from 30 other fungal species frequently found on pistachio. PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis using the restriction enzyme Fnu4HI allowed differentiation of the PCR fragment of wild type cyt b gene from that of mutated gene. This method will aid in a fast detection of azoxystrobin resistance in these three Alternaria species.