用于转基因玉米品系检测的PCR芯片的应用研究

本研究旨在建立一种能够对多种转基因玉米进行同时检测的PCR芯片,用于玉米及其制品中的转基因成分的检测。在实验中选择了6种转基因玉米品系(BT10、BT11、BT176、GA21、MON863、MON89034)和1种非转基因玉米作为实验材料,对PCR芯片的特异性和灵敏度进行了测试。结果表明,该研究成功构建了能够同时对6种转基因玉米品系进行检测的PCR芯片,且芯片具有较高的特异性,检测灵敏度可达0.1%。该PCR芯片检测结果可靠,可用于玉米及其制品转基因成分的检测。     

转基因延熟番茄"华番一号"的品系特异性检测方法

本文使用反向PCR方法克隆了转基因延熟番茄"华番一号"(Bioscein)的外源基因和番茄基因组之间的一段边界序列,并依据此段序列设计了具有品系特异性的引物和荧光探针,以实时荧光PCR技术建立了华番一号的品系鉴定检测方法,扩增片段长108bp,横跨在Nos启动子和番茄基因组之间.以转基因大豆(RR)、转基因玉米(Mon810)、转基因抗草甘膦油菜、转基因棉花(保龄棉)、非转基因番茄、马铃薯、茄子、大椒、大米、小麦、烟草等为试材,证明本方法同其它转基因作物及其它蔬菜无非特异性反应.本方法在检测华番一号番茄时,相对检测灵敏度可达到0.1%,绝对灵敏度达到20个拷贝.由于本方法的PCR扩增产物长度只有108bp,因此该方法也可以用于检测加工产品中的转基因成分,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法.     

应用hiTAIL-PCR扩增转基因木瓜的侧翼序列

品系特异性检测是实施转基因产品标识管理的技术保障,而获取转基因品系的侧翼序列是建立品系特异性检测方法的前提。本研究应用hi TAIL-PCR扩增两个抗病毒转基因木瓜品系的RB区侧翼序列。结果表明,海南木瓜样品为转基因木瓜品系18-2-4,送检木瓜样品为转基因木瓜品系16-0-1。与传统TAIL-PCR方法相比,hi TAIL-PCR扩增的非目标片段和小片段少,获得目标片段的成功率高,是快速扩增已知序列邻近的侧翼序列的好方法。     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。     

转基因番木瓜GM YK品系的LAMP检测

应用环介导等温扩增技术建立一种快速灵敏的转基因番木瓜GM YK品系检测方法。针对转基因番木瓜GM YK品系外源基因与内源基因结合处序列设计1组特异性引物,利用SYBR Green荧光PCR仪实时监测扩增过程,对反应体系进行优化。用优化后的反应体系检测LAMP方法的灵敏性、特异性,并对市售番木瓜进行检测。LAMP检测方法反应速度快,在60 min内即可完成扩增,检测结果易于观察,通过肉眼观察染色情况即可分辨,该方法灵敏度高,检测限可达到5.78 pg,并且具有良好的特异性。LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测转基因番木瓜GM YK品系,并适用于基层和现场检测。     

转基因玉米Mir162品系的实时PCR及可视芯片检测方法研究

本研究以转基因玉米品系Mir162的性状基因vip3a为靶标,建立了实时荧光PCR和可视芯片检测方法。结果表明两种方法都能特异性检测玉米Mir162品系,其中实时荧光PCR检测的相对灵敏度可达0.001%,可视芯片检测灵敏度达0.01%。本研究建立的方法可用于进境转基因玉米中Mir162品系的检测。     

进口转基因玉米品系特异性检测

从文献、网站和数据库中收集了14个转基因玉米品系特异性定量检测方法,将这些方法应用于从美国进口的近60万t转基因玉米的检测,检出了国家批准的11个转基因品系,还在全国首次从大宗原粮中检出国家未批准转基因玉米品系MON89034。这为转基因玉米品系特异性检测标准的制定打下了基础。     

应用RFLP特异基因片段检测绿豆成分

通过对绿豆RFLP分子标记图中特异片段序列的扩增，建立了一种利用PCR方法来检测、鉴定绿豆成分的方法。该方法成功地扩增出了470bp大小的绿豆特异基因片段，通过对大豆、豇豆等其他豆类作物的验证，表明该引物具有较强的特异性，可以用来作为食品中绿豆成分的鉴定基因或绿豆转基因检测中的参照基因。     

向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法的建立

向日葵茎溃疡病菌(Diaporthe helianthi)是我国进境植物检疫性病原真菌。本研究针对D.helianthi的cal基因保守序列设计特异性引物,建立该病菌的重组酶聚合酶扩增检测技术(RPA)方法,并对其特异性、灵敏度及适用性进行评价。结果显示,建立的RPA方法特异性强,只有3个D.helianthi样品能够检测到234 bp的目的片段;方法灵敏度达到0.1 ng/μL;从模拟带菌的种子中也能够成功检测到目标扩增片段。本研究建立D.helianthi的RPA检测方法具有较高的特异性和灵敏度,能够直接应用于种子带菌检测,适用于口岸进境向日葵籽的现场快速检测。     

应用双重数字PCR对转基因玉米成分进行定量方法研究

基于微滴式数字PCR平台,研究建立了一种在同一个微滴反应体系中同时测定样品中两种靶序列的双重微滴式数字PCR定量方法。结果表明,所建立的T25品系双重PCR方法能特异性检出转基因玉米T25,而其他转基因玉米、油菜、水稻等作物品系均没有扩增。灵敏度实验数据表明,所建立的T25双重数字PCR方法,在相对标准偏差≤25%时可以检测到4.6个T25特异性边界序列分子,在不考虑各重复间相对标准偏差的情况下可以检测到1个拷贝。定量结果准确性比较研究显示,与采用分别定量内源基因和T25边界序列来定量转基因成分结果相比较,所建立的T25双重数字PCR定量结果因消除了取样误差结果更准确,以上研究结果表明双重微滴式数字PCR定量方法比单重微滴式数字PCR定量方法更适用于进出境农产品转基因成分的定量检测。     

转基因溶菌酶羊hLZ-J1品系特异性数字PCR方法及样本中痕量转基因成分检测

人溶菌酶是一种天然抗生素，具有抗细菌、真菌，抗炎症，预防感染等功能。转基因溶菌酶山羊可以在乳腺中特异性表达，从而可以从羊乳中规模化制备溶菌酶。本研究旨在建立一种适用于痕量样本中转基因溶菌酶羊成分定量检测的品系特异性数字PCR方法，并利用该方法对山羊的血液、羊奶、粪便和环境土壤样本等进行检测，用于对转基因溶菌酶山羊成分的溯源。建立的数字PCR方法具有高特异性、灵敏度、准确性，检测限和定量限低至15个拷贝每个反应，可以对羊血、羊乳等制品进行准确的定量检测。研究结果还表明该方法可以准确测定粪便和环境土壤样本中的痕量转基因溶菌酶羊成分，可进一步用于转基因动物外源基因的水平转移检测及环境风险评估。     

抗草甘膦转基因大豆Cp4-epsps基因快速简便的LAMP检测方法

针对抗草甘膦转基因大豆的外源基因Cp4-epsps,建立了一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的抗草甘膦转基因大豆的检测体系,其扩增产物既可利用常规琼脂糖凝胶电泳检测,还可通过SYBR Green I染色进行快速检测。LAMP检测体系中dNTPs浓度为0.8 mmol/L、Mg2+浓度为3mmol/L、反应时间为45min时扩增效果最佳,其检测灵敏度为5μg/L,比常规PCR灵敏100倍。田间实际检测结果表明,LAMP检测结果和PCR检测结果完全一致,准确率为100%。本研究所建立的抗草甘膦转基因大豆LAMP检测方法具有简便快速、特异性强、灵敏度高等特征,是一种能够用于抗草甘膦转基因大豆检测、田间基因漂移监测和环境安全研究的有力工具。     

莴苣花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

根据莴苣花叶病毒(Lettuce mosic virus,LMV)的外壳蛋白保守位点设计引物,并构建片段大小为428 bp的内标质粒,利用引物和内标质粒对可侵染莴苣的5种病毒和与LMV同属的3种病毒进行反转录重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测。结果表明,该方法特异性强,可从阳性样品RNA中扩增出大小为272 bp的目标片段,而其他7种病毒RNA、空白对照以及阴性对照均未扩增出条带;灵敏度高,能检测出稀释100倍的LMV RNA,与常规RT-PCR灵敏度一致;速度快,整个扩增过程只需要40 min,不需要特殊设备。本研究建立的RT-RPA检测方法可应用于LMV的快速检测。     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

南方、花生和爪哇根结线虫PCR检测方法

为快速、准确、稳定的鉴定南方、花生和爪哇根结线虫,利用已报道的南方和爪哇根结线虫的两对特异性引物,结合本研究设计的花生根结线虫特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了3种根结线虫的PCR检测方法。结果表明,该方法能够特异性扩增以上3种根结线虫,特征片段长度分别为399、335和670 bp,灵敏度达到单条2龄幼虫的水平。研究结果将为以上3种根结线虫的快速鉴定提供技术支持。     

抗病毒转基因木瓜的分子检测

本研究测定了抗病毒转基因木瓜品系55-1、GM YK和华农1号的结构特征序列,并根据测序结果设计、合成了结构特异性检测引物,建立了55-1、GM YK和华农1号的结构特异性检测方法.为提高检测效率,将结构特异性检测引物和内源基因检测引物置于同一反应体系之中,建立了转基因木瓜品系的两重PCR检测方法.本研究建立的PCR检测体系可用于进口木瓜的检测,从中发现未经我国批准的转基因木瓜品系,为转基因产品的标识管理提供技术支持.     

菜豆种子中菜豆普通花叶病毒的RT-PCR检测

为研究国家作物种质库中保存菜豆种质携带种传菜豆普通花叶病毒（BCMV）的状况，根据BCMV的印基因序列设计一对特异性引物，从BCMV侵染的菜豆叶片上扩增出与理论大小一致的714bp的片段。在此基础上，应用改进CTAB法从菜豆干种子中提取总RNA并特异性扩增出相同大小的片段。对目的片段进行克隆、测序和序列同源性比较，结果表明，扩增片段的序列与其它BcMV的印基因序列同源性达88％-98％，确证该方法可以从莱豆干种子申直接检测BCMV。利用建立的方法，分别从单粒菜豆种子样本和30粒菜豆种子样本中检测到BCMV，其检测灵敏度较ELISA方法更高。来自河北的紫芸豆单粒种子带毒率高达100％，而在不同地理来源的6份菜豆种质中，4份被检出携带BCMV，表明入库保存的菜豆种质和种子已普遍为BCMV所侵染。     

向日葵黄萎病病原菌轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法

为建立可同时快速检测引起向日葵黄萎病害的2种检疫性病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.和黑白轮枝菌V.albo-atrum Reinke et Berthold的方法,根据2种病原菌的β-tubulin基因分别设计特异性DPO引物,建立多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅大丽轮枝菌和黑白轮枝菌可分别扩增出225 bp与151 bp的特异性条带,其它向日葵病害的7种病原菌及阴性对照均无目的条带;反应体系中引物终浓度为0.2μmol/L、退火温度为60℃时,30个扩增循环的检测灵敏度均可达0.05 ng菌丝DNA量;在45~65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段,表明该方法退火温度范围宽。所建立的检测方法能够准确、高效地检测引起向日葵黄萎病的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌,可用于向日葵种子带菌筛查及田间病害诊断检测。     

杜松烯合成酶作为转基因棉花PCR检测的内参照基因

根据棉属植物中棉酚合成的关键酶之一杜松烯合成酶[（＋）-d-cadinene syhnthase]基因序列，设计合成了该酶的实时荧光PCR的引物和TaqMan探针，经研究发现，此套引物探针能特异性检测海岛棉和陆地棉，有较高的检测灵敏度。同马铃薯、大椒、茄子、烟草、番茄、玉米、大豆、小麦、水稻和其它转基因作物无非特异性反应，可以作为转基因棉花检测的内参照。     

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列，筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明，优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10³ fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析，表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1～1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择，对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。