我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测

对山东泰安、辽宁大连和北京的樱桃病毒病发生情况进行调查,发现8个果园/栽培区均有病毒病发生,主要症状为叶片皱缩、畸形、卷叶、花叶、植株矮缩等。采集20份样品,利用12种病毒的引物进行RT-PCR检测。结果表明,在样品中扩增出与樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV),李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、李树皮坏死与茎痘伴随病毒(Plum bark necrosis stem pitting-associated virus,PBNSPaV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)、樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1,LChV-1)预期大小一致的目的片段;序列分析表明,与GenBank中注册所测的病毒核苷酸序列均具有较高的一致性。其中,大连、泰安和北京样品均检测到CVA;大连和北京样品中检测到PNRSV和PDV;北京样品中检测到PBNSPaV;大连苗木样品枝条中检测到CGRMV和LChV-1。这是在我国樱桃上首次检测到LChV-1。     

河南甜樱桃病毒病害调查及病原检测

在河南省郑州市、巩义市、荥阳市、新郑市选择具有代表性的甜樱桃生产园对病毒病发生情况进行调查,采集表现为疑似病毒病症状的样本65份,利用7种病毒引物进行RT-PCR检测。5种病毒检测结果呈阳性,分别是李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)、樱桃坏死锈斑病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)及樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA);序列分析结果表明,5种病毒扩增片段与GenBank中注册的相应病毒核苷酸序列均具有较高的一致性;样本病毒检出率为100%,其中13份样本为单独侵染,其余52份样本均为多病毒复合侵染,占比高达80%,复合侵染比例随着侵染病毒种类的增多逐渐降低;病毒侵染组合与叶片表型症状无明显对应关系。     

SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf vi-rus,PDV)、樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,LChV-2)的甜樱桃"红灯"Prunus avium cv.Red Lamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA-CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2-CP表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2-CP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

环渤海湾地区甜樱桃小果病毒及樱桃病毒A的鉴定与调查

为了解环渤海湾地区甜樱桃[Cerasusavium (Linn) Moench]中樱桃病毒的发生情况,选取该地区代表性樱桃示范园中甜樱桃品种‘红灯’为研究对象,以生长期功能叶片为材料,根据樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1,LChV-1)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,IChv-2)和樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)基因组序列设计特异性检测引物进行RT-PCR扩增,结果扩增出与LChV-2、CVA预期片段337 bp和652 bp大小相符的目的片段,测序结果与基因组(基因登录号NC-005065、NC-003689)对应片段一致性分别为89.0％、98.2％,未检测到LChV-1.本研究完成了对环渤海湾地区甜樱桃‘红灯’样品LChV-2、CVA的检测调查,LChV-2检出率43.1％,CVA检出率60.8％;在该地区首次发现LChV-2、CVA复合侵染植株,复合检出率37.3％0.结果表明该地区CVA发生较为普遍,可与LChv-2等其他病毒共同加重对甜樱桃的危害.     

侵染肥城桃的病毒和类病毒的分子检测与鉴定

为明确山东肥城桃种植区桃树上主要存在的病毒和类病毒及其发生情况,采集具有花叶、斑驳和皱缩典型症状的肥城桃样品,提取叶片总RNA后,分别选用桃树上已报道的啤酒花矮化类病毒Hopstuntviroid(HSVd)、桃潜隐花叶类病毒Peach latent mosaic viroid(PLMVd)、苹果褪绿叶斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV)、樱桃锉叶病毒Cherry rasp leaf virus(CRLV)、桃花叶病毒Peach mosaic virus(PMV)、李属坏死环斑病毒Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV)、李痘病毒Plum pox virus(PPV)、李矮缩病毒Prunus dwarf virus(PDV)、樱桃绿环斑驳病毒Cherry green ring mottle virus(CGRMV)、杏假褪绿叶斑病毒Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus(APCLSV)、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒Plum bark necrosis stem pitting-associated virus(PBNSPaV)和小樱桃病毒1号Little cherry virus 1(LchV1)的特异性引物进行RT-PCR检测。PCR结果显示仅HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV的扩增产物中得到了预期大小的目的片段,将目的片段克隆测序后,经NCBI BLAST比对发现,山东肥城桃分离物HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV与GenBank已报道分离物序列一致性均达90%以上。表明山东肥城桃已感染HSVd、PLMVd 2种类病毒和ACLSV、PNRSV、PBNSPaV 3种病毒。     

SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBRGreenI实时定量RT—PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune Dwarf vi—rus,PDV）、樱桃病毒A（CherryvirusA,CVA）、樱桃小果病毒一2（Little cherry virus一2,LChV－2）的甜樱桃“红灯”PrunusaviumCV．RedLamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA—CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2一卯表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2一cP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

两种主要甜樱桃病毒RT-PCR检测方法的改进

李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)和李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)是较为常见且危害严重的两种植物病毒,1992年被我国列为进境检疫危险性有害生物,主要危害李属和蔷薇属植物.反转录-聚合酶链式反应检测法(RT-PCR)因操作简便且灵敏度高而备受青睐.利用该方法已分别从北京怀柔[1-2]及大连地区[3]栽培的桃、樱桃中检测到PNRSV和PDV两种病毒.由于PNRSV和PDV同属雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属,且传播方式相似,往往同时发病.已有的RT-PCR检测方法,一次反转录操作仅能检测一种病毒,耗时长、效率低,急需建立新的RT-PCR检测体系.本试验采用随机六聚体引物进行反转录,对RT-PCR检测方法进行了改进.     

同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的二聚cRNA探针制备和应用

<正>樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)和桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid,PLMVd)是桃树上的主要病原。在检测中发现,我国桃树病毒多以CGRMV与PLMVd复合侵染为主,侵染率较高。通过分子克隆,串联几个病毒核酸序列合成多聚探针,能同时检测多个病毒和类病毒(Torchetti et al.,2012)。目前尚无关于CGRMV单一探针和同时检测CGRMV与PLMVd二聚探针的报道。本研究通过设计带酶切位点的特异引物制备二聚cRNA探针,以期建立适用于田间果树样品中CGRMV和PLMVd的快速检测技术,为桃树病毒病害的防治提供理论基础。     

樱桃小果病毒1号胶体金免疫层析试纸的研发与应用

近年来，病毒病在甜樱桃主产区的发生呈上升趋势，制约了甜樱桃产业升级和发展。能够侵染甜樱桃的病毒种类中，樱桃小果病毒1号(little cherry virus 1,LChV-1)导致樱桃果实缩小，彻底丧失经济价值，对甜樱桃产量影响较大。LChV-1通常具有潜伏侵染的特性，在樱桃苗期难以通过症状进行判断。同时，多数品种对LChV-1敏感，因此该病毒的早期检测对甜樱桃的生产尤为重要。传统的病毒检测手段需要专业仪器，不能满足田间快速检测的需求。本研究获取了LChV-1外壳蛋白的多克隆抗体，并研发了一种能够准确检测LChV-1病毒的胶体金免疫层析试纸，确定了胶体金的最佳抗体标记浓度为0.24 mg/mL,检测线最佳重组蛋白浓度为0.25 mg/mL,质检线最佳羊抗兔IgG抗体浓度为0.04 mg/mL。运用该试纸检测只需10～15 min,检测时间短、成本低、结果容易判断，可用于田间快速检测。本研究为樱桃小果病的综合防控提供了有效的监测和检测手段。     

我国梅树上病毒及类病毒的检测和鉴定

目前, 我国梅树上的病毒种类及发生情况仍不完全清楚。本研究从北京、武汉、南京和无锡的梅园中采集了64份疑似感染病毒的叶片样品, 通过RT-PCR和斑点杂交, 对7种病毒和2种类病毒进行了检测。共检测到6种病毒和1种类病毒。其中, 李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)和桃潜隐花叶类病毒(peach latent mosaic viroid, PLMVd)为我国梅树上的首次检出。PNRSV、亚洲李属病毒2号(Asian prunus virus 2, APV2)、桃叶痘伴随病毒(peach leaf pitting-associated virus, PLPaV)的检出率高于30%。综合考虑病毒的分布及检出率, PLPaV、APV2、PNRSV和李树皮坏死茎痘伴随病毒(plum bark necrosis stem pitting-associated virus, PBNSPaV)是武汉、南京和无锡梅树上的主要病毒。此外, 通过克隆和测序, 获得了PLMVd和梅树病毒A(mume virus A, MuVA)的基因组, PLPaV的RNA1组分和PNRSV外壳蛋白(CP)基因序列。序列比较分析显示, 我国PLMVd梅分离物和PNRSV梅分离物与我国桃分离物亲缘关系最近, 表明PLMVd和PNRSV可能在梅和桃树间交互侵染;我国MuVA梅分离物序列与日本梅分离物序列的相似性高达98.56%;PLPaV梅分离物与我国桃分离物之间序列变异较大。上述结果不仅进一步明确了我国梅树上的病毒及类病毒种类和分布情况, 而且有助于深入了解它们的流行与传播。     

北京月季病原病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测

 本研究利用高通量测序技术对北京地区的月季染病样品进行了病毒鉴定,通过序列比对和拼接获得了李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、月季黄叶病毒(rose yellow leaf virus,RYLV)、月季黄花叶病毒(rose yellow mosaic virus,RoYMV)、月季潜隐病毒1(rose cryptic virus1,RCV1)和玫瑰黄脉病毒(rose yellow vein virus,RYVV)等7种已知病毒和2种未知病毒的序列信息。分别对PNRSV,ASGV和RYLV园博园分离物的外壳蛋白基因进行系统进化分析,结果表明PNRSV-YBY归属于PV32组,ASGV-YBY归属于Ⅰ组,RYLV-YBY为玫瑰叶畸形病毒(Rosa rugosa leaf distortion virus, RrLDV)的一个新的分离物。对中国农业大学校园、北京植物园、北京动物园和北京园博园的37份样品进行了PNRSV、ASGV和RYLV的RT-PCR检测,检出率分别为41.7%、44.4%和10.8%。本研究初步明确了侵染北京月季的病毒种类和侵染情况,为月季病毒病的检测和防控提供参考。     

进境玫瑰鲜切花李属坏死环斑病毒的检测鉴定

近期上海口岸连续多次从进境的玫瑰鲜切花中检出我国检疫性有害生物李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV),通过DAS-ELISA、RT-PCR、SYBR Green I实时荧光RT-PCR和序列分析等4种方法分别检测和复验该病毒,结果均为阳性,由此确定从进境玫瑰鲜切花中检出了PNRSV。同时本文分别检测玫瑰叶片、花瓣、茎干和花萼,结果均带有PNRSV,确定该病毒系统侵染玫瑰。     

樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。     

环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒

小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

引起甘蔗花叶病的病原分子生物学进展

花叶病是最主要的甘蔗病毒病害之一,在全球种植甘蔗的国家或地区普遍发生,可导致甘蔗产量下降,糖分减少,给甘蔗生产带来严重的经济损失。引起甘蔗花叶病的病毒主要有甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,Sr MV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)。本文综述了这3种病毒的生物学特性、鉴定与检测、基因组结构与基因功能、遗传变异与分子进化等方面的研究进展,并讨论了对甘蔗花叶病的生态防控措施。     

二温式多重RT-PCR同删两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,建立了二温式多重RT-PCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增,结果同时得到2条大小与实验设计相符的769bp(Cy MV)、1000bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测,结果11个样品检测出Cy MV,阳性率28.2%;24个样品检测出ORSV,阳性率61.5%;6个样品同时检测出两种病毒。     

香蕉3种主要病毒的多重PCR检测

根据香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)3种病毒核酸保守序列设计相应特异性引物,通过体系优化,建立了可以同时检测香蕉束顶病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒的多重PCR体系。     

二温式多重RT-PCR同时检测两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物，建立了二温式多重RTPCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增，结果同时得到2条大小与实验设计相符的769 bp(CyMV)、1 000 bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测，结果11个样品检测出CyMV，阳性率28.2%；24个样品检测出ORSV，阳性率61.5%； 6个样品同时检测出两种病毒。     

基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染广东省冬种马铃薯的病毒

为明确侵染广东省冬种马铃薯的病毒种类及优势病毒,结合小RNA深度测序技术及RTPCR检测方法,对采集于广东省冬种马铃薯7个主产区的189份疑似病样进行检测分析。结果表明,经小RNA深度测序技术检测马铃薯病毒病混合样,发现存在马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)和马铃薯卷叶病毒(Potato leaf-roll virus,PLRV)3种病毒。进一步设计3种病毒的特异性引物并利用国内已报道的其它5种马铃薯病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,发现189份马铃薯病毒病疑似病样中仅检测到PVY、PVS和PLRV这3种病毒,检出率依次为75.13%、10.05%和4.76%,且3种病毒在马铃薯上还存在复合侵染,复合侵染率为14.19%,其中PVY在各马铃薯产区均可检测到。表明侵染广东省冬种马铃薯的病毒为PVY、PVS和PLRV,其中PVY是优势病毒。     

利用实时荧光定量PCR技术检测樱桃叶斑驳病毒

樱桃叶斑驳病毒(Cherry mottle leaf virus,CMLV)是南美洲樱桃上重要的病害之一。本研究针对Genbank上公布的该病毒的核酸序列,人工合成了CMLV(AF170028.1)6741～7322 nt的核酸序列并连接载体,构建了阳性标准质粒,进行实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测。实验结果表明,本研究设计的利用FQ-PCR检测CMLV的引物及探针特异性良好,经灵敏度检测,最低检测浓度为23 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。该FQ-PCR检测方法为樱桃叶斑驳病毒的防控提供了重要的技术支持。