链格孢菌抗植物病原真菌活性筛选

活性筛选是开发利用微生物资源的第一步,在生物农药、抗菌素及天然药物开发颇为急切的今天,对微生物抑菌活性的研究具有重要的理论和现实意义。本研究以水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、小麦雪腐病菌（Typhula incarnate）等10种重要植物病原真菌为研究对象,采用滤纸片法对云南西双版纳地区分离得到的20株链格孢菌（Alternariaspp．）进行抗菌活性筛选,获得对10种植物病原菌有广谱抗性的链格孢菌4株,编号分别为SWFC0364,10102,0845,5828,其中菌株0364的抑菌活性最强,对小麦雪腐、梨黑星、三七丝核的抑菌圈直径均达到2cm以上,该研究结果为活性物质的分离奠定了基础。     

浑圆链霉菌QH-16鉴定及抑菌活性产物的结构研究

拮抗放线菌能够产生具有较高商业价值的生物活性物质,应用潜力巨大。本研究以桃细菌性穿孔病菌Xanthomonas arboricola pv. pruni为指示菌,采用平板对峙法从已有拮抗菌库中筛选对病原菌具有抑制作用的拮抗放线菌,发现菌株QH-16的拮抗效果最佳,通过16S rDNA序列分析,结合形态特征、培养特性和生理特性,鉴定该菌为浑圆链霉菌Streptomyces globosus。离体测定其对多种植物病原菌及细菌具有很好的抑菌作用,琼脂平板打孔法测定对禾谷镰刀菌的抑菌带宽达14 mm;对枯草芽胞杆菌抑菌圈直径达24 mm。采用溶剂萃取法提取菌株QH-16发酵产物的活性成分,通过硅胶柱层析、制备型薄层色谱（PLC）以及循环制备型色谱制备纯品化合物,经核磁共振法解析,确定其中的抑菌活性单体化合物为邻苯二甲酸二丁酯。     

昆虫抗菌肽及其利用

抗菌肽是昆虫体液免疫中重要的抗菌因子，具有广谱抗菌性。不仅能杀死革兰氏阳性及阴性菌，还有抗真菌、病毒、原虫及抑制癌细胞的活性。本文简述国内外抗菌肽的研究状况以及抗菌肽在转基因植物、动物方面的应用成果及存在的问题。     

马铃薯环腐病生防菌株P1的鉴定、防病效果及促生作用研究

 在马铃薯环腐病区采集健康的马铃薯Solanum tuberosum块茎,从中分离到1株对马铃薯环腐病菌Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum具有强拮抗作用的内生细菌P1。经形态观察、生理生化鉴定,菌株P1归属为Bacillus sp.,进一步经16SrDNA序列对比分析,确定为巨大芽孢杆菌B. megatherium。经证明,P1菌株的培养液抗菌粗提物属于蛋白类,该抗菌蛋白对紫外光不敏感,pH为7.0时抑菌活性最强,温度高于80℃时抑菌活性明显下降。温室试验表明,P1菌株能显著提高马铃薯植株的株高、茎粗、产量及大薯率,其对马铃薯环腐病防效达53.4%。     

木霉对5种病原菌抑菌活性筛选

采用滤纸片法对云南地区分离并鉴定到的15株木霉进行2株病原细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)和3株植物病原真菌(小麦全蚀、番茄早疫、稻疫)抗菌活性筛选。获得可抑制5种病原菌(广谱)的木霉7株。抑菌圈直径范围在0.7～2.8 cm。其中哈茨木霉8917提取物对3株植物病原真菌的抑制最强,哈茨木霉10176提取物对金黄色葡萄球菌的抑制最强,哈茨木霉10174提取物对大肠杆菌的抑制最强。同时,将15株供试木霉与3株病原真菌进行对峙培养,结果显示:对番茄早疫菌抑制率最高的是新康氏木霉8722和深绿木霉8956,对小麦全蚀菌抑制率最高的是新康氏木霉8722和康氏木霉8701,深绿木霉8686对稻疫菌的抑制率最高。哈茨木霉在滤纸片法活性筛选中相对其他木霉抑菌活性较好,但在对峙培养活性筛选中其抑菌活性最弱。     

大蒜提取液抑菌活性及其稳定性分析

本文研究了大蒜提取液对19种植物病原菌的抑制作用及其在不同条件下对番茄早疫菌的抑制效果。结果发现大蒜提取液对19种植物病原菌均具有明显抑制作用,但抑菌效果有明显差别;巯基乙醇对大蒜提取液抑菌活性具有拮抗作用,胱氨酸对大蒜提取液抑菌活性具有协同作用;大蒜提取液在常温、低温、短期光照和中偏酸性等条件下抑菌效果较稳定;大蒜提取液对60℃及更高温度、碱性、过酸等条件处理敏感,抑菌活性降低很快。本研究发现大蒜提取液对植物病原真菌具有广谱抑制效果,并初步确定了大蒜提取液的抑菌稳定条件,为开发大蒜类有机农药提供了理论依据。     

贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的鉴定及其对草莓根腐病的防效

为获得草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的优良拮抗菌,以草莓种植基地的土壤为拮抗菌来源,通过室内测定不同菌株的抑菌活性,筛选抑菌率最高的菌株,在此基础上对所筛菌株进行分类鉴定,并评价其抑菌谱和防效。结果表明,从土壤中分离获得39株拮抗菌,筛选出3株对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用的菌株。其中,菌株ZZBV-3的抑菌作用最强,抑菌圈直径为16.2 mm。经形态学及多基因（包括16s rDNA和gyrB基因）比对分析,确认菌株ZZBV-3为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。菌株ZZBV-3抑菌谱广,对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果。盆栽试验结果表明,菌株ZZBV-3对草莓“红颜”和“甜查理”品种的根腐病防效分别为77.96%和81.18%,生防应用前景良好。     

特基拉芽胞杆菌JN-369抗菌粗蛋白的理化性质和抑菌效果

特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis JN-369是1株对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有较好拮抗作用的植物内生细菌，其发酵液经硫酸铵沉淀后得到抗菌粗蛋白。为明确菌株JN-369抗菌粗蛋白的抑菌机理，首先确定了该抗菌粗蛋白抑菌谱、热稳定性、酸碱稳定性、紫外稳定性以及酶稳定性，并观察研究了抗菌粗蛋白对稻瘟病菌菌丝和分生孢子的抑制作用。并采用针刺离体接种法测定了40%稻瘟灵EC、25%三环唑WP及不同浓度JN-369抗菌粗蛋白对水稻稻瘟病的拮抗效果。结果表明：菌株JN-369抗菌粗蛋白抑菌谱广，对葡萄灰霉病菌、草莓灰霉病菌和水稻稻瘟病菌等13种植物病原真菌及卵菌表现出抑制作用，而对油菜菌核病菌没有抑制作用；该粗蛋白理化性质相对稳定，具有应用于粮食作物生物防治的潜力；对稻瘟病菌的菌丝生长和分生孢子萌发有双重抑制作用，能使病原菌菌丝细胞膨大，并可抑制病菌分生孢子的萌发；离体防效试验显示，供试杀菌剂对水稻稻瘟病均有显著的拮抗效果，菌株JN-369抗菌粗蛋白在浓度为50～100 μg/mL时对稻瘟病的拮抗效果最好，该菌株有望开发为防治稻瘟病的生防菌株。     

枯草芽胞杆菌Y13挥发性物质的分析及抑菌活性

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Y13是一株高效广谱的生防菌，对油茶主要病害具有较好的生防效果，试验表明其发酵产生的挥发性物质对油茶炭疽病菌有较好的抑制作用。对菌株Y13产生的挥发性物质进行定性定量分析，并测定其抑菌活性，为油茶病害无公害防治及药剂开发提供理论依据。采用顶空固相微萃取技术（HS-SPME）和气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）收集并分析Y13挥发性物质成分，购买相应挥发性物质纯品，采用双皿倒扣法测定其抑菌活性。Y13挥发性物质对10种植物病原真菌抑菌率在19.2%～83.9%，其中挥发性物质对果生炭疽菌Colletotrichum fructicola的抑菌活性最强，抑菌率达到83.9%；检测其中10种挥发性化合物纯品对果生炭疽菌的抑菌活性发现，除了正十八烷外，其他9种挥发性化合物纯品均具有不同程度的抑菌活性；筛选出的4种高效抑菌挥发性化合物纯品对7种常见的油茶病原真菌的抑菌活性检测结果表明，4种挥发性化合物纯品（10 μL/平板）对7种常见的油茶病原真菌均具有较好的抑菌活性，抑菌活性壬醛 > 苯甲醛 > 3-甲基-4-苯基吡唑 > 苯丙噻唑。Y13挥发性物质对油茶主要病害病原菌有很好的抑制作用，具有一定的研究意义和良好的开发价值。     

油菜菌核病菌拮抗放线菌HPS02的分离、鉴定及其代谢产物性质研究

为控制油菜菌核病在油菜生产上的扩散,挖掘该病的生防资源,以油菜菌核病菌为指示菌,从湖南怀化收集的土样中分离出4株拮抗放线菌株。其中菌株HPS02的抑菌效果最好,无菌发酵液对油菜菌核病菌的菌丝生长抑制率高达91. 04%。经菌株培养性状、形态观察、生理生化鉴定,并结合16SrDNA序列分析,将该菌株鉴定为阿布拉链霉菌（Streptomycesaburaviensis）。抗菌谱研究表明,该菌株对多种植物病原菌都有拮抗作用。发酵液稳定性结果表明,该菌株发酵液对酸碱较为稳定,对温度、紫外线较为敏感。通过硫酸铵沉淀发酵液,其沉淀的抑菌活性与发酵原液一致。经4种不同有机试剂萃取后,萃余相的抑菌活性与原发酵液的抑菌活性相差很小。该研究结果为油菜菌核病的生物防治提供科学依据。     

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

 通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T₀和T₁代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。     

解淀粉芽胞杆菌MH71抗菌物质理化特性及对番茄灰霉病菌的抑菌活性

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens MH71是一株高效广谱拮抗活性菌株,明确该菌株发酵液中活性物质的理化特性和抑菌活性,为解淀粉芽胞杆菌生物农药开发应用奠定坚实的基础。本研究在对菌株MH71抑菌活性物质理化特性研究的基础上,以番茄灰霉病菌为供试致病菌,探究了抗菌活性物质对番茄灰霉病菌的抑菌作用;采用酸沉淀和硫酸铵沉淀分别获得脂肽类和蛋白类活性物质,SDS–PAGE电泳和HPLC分别对活性物质进行检测。该菌活性物质具有较强的耐热性和pH适应性,100 ℃处理60 min和121 ℃处理30 min后抑菌活性分别为原有活性的88.98%和79.60%,在pH 3～11时均有抑菌活性,且对紫外线、蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。该抗菌活性物质对番茄灰霉病菌菌丝的毒力测定结果表明,不同浓度发酵液处理的番茄灰霉病菌菌丝呈现出较多局部膨大或溢缩等异常菌丝。其发酵液经酸沉淀法得到抗菌脂肽类活性物质,经硫酸铵沉淀法得到抗菌蛋白,脂肽类的抑菌活性高于抗菌蛋白类物质,SDS–PAGE电泳检测,得到约40 kD的蛋白条带,HPLC检测表明该抗菌物质中有surfactin存在。     

甲基营养型芽胞杆菌G-1抗菌肽的分离及抑菌作用研究

为探索甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus G-1抑制番茄灰霉病菌的作用机制，采用HPLC、LC-MS等对其分泌的抗菌肽进行分离鉴定，通过扫描电镜观测抗菌肽对番茄灰霉病菌菌丝形态影响，借助RNA-seq研究抗菌肽处理番茄灰霉病菌3、5 d后的差异表达基因。研究结果表明：甲基营养型芽胞杆菌G-1产生的抗菌肽主要为伊枯草菌素A。经菌株G-1抗菌肽处理后，番茄灰霉病菌菌丝生长异常，菌体畸形肿胀，内溶物外渗。基因差异表达分析表明，有40个基因在2个时期均差异表达。GO、KEGG富集分析发现，与萜烯合酶、氨基酸跨膜转运相关的15个基因在各时期均上调表达，与细胞表面受体信号通路、氧化还原酶、果胶裂解酶、单加氧酶等有关的25个基因在各时期均下调表达，其中编码琥珀脱氢酶（SDH）的Bcin02g06840基因及编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的Bcin04g04450基因表达量显著下调。经qRT-PCR验证，8个差异表达基因的表达模式变化与转录组测序分析结果一致。研究表明菌株G-1抗菌肽可能通过抑制番茄灰霉病菌细胞膜组分中SDH、HMGR的合成抑制菌丝及孢子的生长。     

细菌诱导家蝇蛹抗菌物质的分离纯化

家蝇生境中充满病原菌,其有效的防防机制成为研究的热点。通过三氟乙酸缓冲液浸提、热处理、固相萃取以及两次RP-HPLC等方法,从混合细菌液诱导的家蝇蛹中分离纯化出4种具有抗菌活性的物质。结果表明,提取的家蝇蛹粗提液抗菌谱较广,对多种微生物具有不同程度的抗菌作用,且抗菌效果好于天然肽类防腐剂和一些化学防腐保鲜剂。4种抗菌物质中包括3个抗菌肽和1个抗菌化合物。Tricine-SDS-PAGE结果显示3个抗菌肽的分子量分别约为12kDa、8kDa和4kDa。本研究表明细菌诱导家蝇蛹中具有丰富的抗菌物质。     

The antimicrobial peptide AsR416 can inhibit the growth,sclerotium formation and virulence of Rhizoctonia solani AG1-IA

European Journal of Plant Pathology - Plant antimicrobial peptides (AMPs) as a part of plant defense responses, are small soluble defense molecules which can inhibit the growth of pathogens. This...     

超量表达益母草种子抗菌蛋白提高番茄的抗病性

为了验证来自益母草Leonums japonicusHoutt种子的抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2对植物病害的广谱抗性,用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法,将其分别转入台湾圣女番茄品种。结果显示,利用黄萎病菌毒素浸泡番茄离体枝条,处理24h,空载转基因对照和非转基因再生植株枝条全部萎蔫,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄T0代枝条未出现萎蔫的株系比率分别为11.11%和6.25%;用离体叶片接种菌块,分别对T0代抗或耐黄萎病菌毒素的T1代株系接种早疫病菌,接种10天,空载转基因对照和非转基因再生植株的病情指数达到100,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄病情指数最低的株系分别为17.5和10.0,表明转基因番茄能同时提高对黄萎病菌毒素和早疫病的抗性;进而用叶盘法检测转基因植株对番茄青枯病菌的抑制作用,结果显示对真菌病害抗性强的转基因植株叶片对青枯病菌的抑菌圈更大。转基因番茄抗病鉴定结果表明,来自益母草种子的LjAMP1和LjAMP2基因对植物病害具有广谱抗性。     

小麦凝集素类受体激酶TaLecRLK1的鉴定及抗锈病功能分析

凝集素类受体激酶(lectin receptor-like kinase, LecRLKs)是一类在植物应答多种生物/非生物胁迫中发挥重要作用的类受体激酶。本研究在小麦与条锈菌互作的转录组中筛选到1个在小麦与条锈菌非亲和互作中显著上调表达的LecRLKs基因TaLecRLK1。该基因全长2 292 bp,编码蛋白含有1个胞外信号肽、B-lectin结构域、PAN＿AP结构域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。qRT-PCR分析表明：TaLecRLK1在小麦与条锈菌非亲和互作早期诱导表达,在烟草及小麦原生质体中瞬时表达,TaLecRLK1-GFP定位在细胞膜上。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)沉默TaLecRLK1,接种无毒性条锈菌小种CYR23后,沉默叶片表面产生少量夏孢子堆,组织学观察发现沉默植株中条锈菌菌丝长度增长、侵染点附近活性氧积累面积减少;TaPR1、TaPR2、TaPR5的表达受到抑制,TaCAT和TaSOD则被迅速诱导表达。综上所述,TaLecRLK1对小麦抗条锈病起到正调控作用。     

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。     

稻瘟病菌激发子诱导非寄主植物的抗病效果

 Hyphal cell wall crude elicitor(CWE)of rice blast pathogen could induce hypersensitive response in tobacco and induce other nonhost plants to be resistant to other fungal pathogens.When corn was treated with CWE,they inhibited the infection of Exserohilum turcicum and Curvularia lunata,and when plants of capsicum and cucumber were treated with CWE,they inhibited the infection of Colletotrichum gloeospori-oides.CWE solution showed no bioactivity on spore germination and hyphal growth of the experiment fungi in vitro.Nonhost resistance induced by CWE to other fungal pathogens was not complete resistance.The induced resistant effect(IRE) increased as CWE concentration increased,however,IRE had somehow satura-ted concentration of CWE.Induced nonhost resistance by incompatible pathogen was quantitative to other compatible pathogens.The induced resistance was best at 2 or 3 d after CWE treatment,and then decreased.IRE was about 20 percent in 10 d after CWE treatment.     

白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交cDNA文库构建及其利用

 拟南芥广谱抗病基因RPW8对拟南芥白粉病菌、霜霉病菌和烟草花叶病毒等均具有抗性。为了深入研究其广谱抗病机制,筛选鉴定与RPW8具有直接相互作用的蛋白,我们以含有RPW8的拟南芥纯合转基因系S5为材料,接种拟南芥白粉菌系UCSC1,36 h后取样,构建了白粉菌侵染初期的拟南芥cDNA文库。为了提高文库对长片段基因5′端的覆盖率,分别使用含有oligo(dT)和oligo(dN)的接头引物反转录cDNA第一链,PCR扩增双链cDNA。将纯化后的双链cDNA与线性化载体pGADT7-Rec混合,利用同源重组技术在酵母菌株Y187中构建cDNA文库。经检测,文库转化效率为5.0×10⁶/3 μg pGADT7-Rec,滴度为2.5×10⁸ CFU·mL^-1,插入片段长度在350～2 000 bp之间,平均插入片段大小为750 bp。用RPW8.1和RPW8.2构建诱饵载体,分别获得11和12个候选互作蛋白。结果表明此cDNA文库质量较好,适用于互作蛋白的筛选。